SIRT1对退变椎间盘髓核细胞凋亡调控及分子机制研究

摘要

第一部分，临床人椎间盘手术髓核标本髓核细胞的分离及培养
　　目的：熟练掌握人退变髓核细胞、正常髓核细胞的培养方法、为后续实验打下基础。
　　方法：应用0.25％的胰酶、0.2％Ⅱ型胶原酶联合消化法从中老年腰椎间盘突出症及青壮年腰椎骨折髓核标本中进行髓核细胞培养，用COL2A1组化鉴定，应用MTT法测定细胞的增殖活性能力。
　　结果：从中老年腰椎间盘突出症髓核手术标本、青壮年腰椎爆裂性骨折髓核手术标本中原代培养出退变髓核细胞及正常髓核细胞及传代培养。最后应用COL2A1一抗进行免疫细胞化学染色反应，证实培养的细胞为髓核细胞。MTT检测证实退变髓核细胞的增殖活性明显低于正常髓核细胞(p<0.05)。
　　结论：用0.25％的胰酶、0.2％Ⅱ型胶原酶联合消化法成功培养出原代退变髓核细胞、正常髓核细胞，并进行传代培养，组化鉴定证实培养的细胞为髓核细胞。退变椎间盘髓核细胞的增殖生长活力低下。
　　第二部分，SIRT1在人退变椎间盘髓核细胞及正常髓核细胞中的表达及意义
　　目的：明确SIRT1在退变髓核细胞及正常髓核细胞中的表达差异及不同髓核细胞的凋亡率情况。
　　方法：用免疫组化、普通逆转录PCR、荧光定量RT－PCR、westernblot方法检测中老年腰椎问盘突出症患者髓核及青壮年腰椎爆裂骨折患者髓核标本中SIRT1、COL2A、aggrecan的蛋白及基因表达差异情况。用TUNEL方法检测中老年腰椎间盘突出症患者髓核及青壮年腰椎爆裂骨折患者髓核标本细胞凋亡率差异。
　　结果：中老年腰椎间盘突出症髓核手术标本组织及培养细胞中的SIRT1、COL2A、aggrecan的蛋白及基因表达均比来自于青壮年腰椎爆裂性骨折髓核手术组织及细胞中的表达显著降低(p<0.05)。中老年腰椎间盘突出症髓核手术标本组织中的细胞凋亡率显著高于青壮年腰椎爆裂性骨折髓核手术组织(p<0.05)。
　　结论：本实验应用免疫组化、PCR、western blot的方法证实了在中老年腰椎间盘突出症退变髓核细胞中SIRT1是低表达，细胞凋亡率增高，SIRT1与细胞凋亡呈反向关系。
　　第三部分，SIRT1对人退变椎间盘髓核细胞凋亡调控及分子机制研究
　　目的：探讨SIRT1是否具有调节退变椎间盘髓核细胞凋亡的功能及其可能的分子机制。
　　方法：用SIRT1表达质粒转染退变髓核细胞、SIRT1激动剂resveratrol、SIRT1-siRNA沉默退变髓核细胞中SIRT1表达、SIRT1抑制剂NAM方法、TNFα及低营养培养基(0.5％FBS)处理退变髓核细胞，用流式细胞仪检测凋亡率变化情况。最后用western blot及PI3K抑制剂LY294002方法检测Akt信号通路相关蛋白的激活表达情况。
　　结果：因退变髓核细胞增殖活力差，SIRT1表达质粒转染未成功。当SIRT1激动剂resveratrol处理退变髓核细胞后，能降低髓核细胞凋亡率(p<0.05)。同时，resveratrol能降低退变髓核细胞对凋亡的敏感性，能抑制TNFα及低营养培养基(0.5％FBS)对凋亡的诱导(p<0.05)。当用SIRT1-siRNA沉默退变髓核细胞中的SIRT1表达及SIRT1抑制剂NAM处理退变髓核细胞后，细胞凋亡率明显增加(p<0.05)。western blot检测SIRT1能使磷酸化Akt蛋白表达显著增高，当用LY294002抑制PI3K/Akt信号后，细胞凋亡率也增加(p<0.05)。
　　结论：SIRT1具有抑制退变髓核细胞凋亡的功能，SIRT1能通过磷酸化Akt信号发挥调节退变髓核细胞凋亡的功能。