CBP介导的组蛋白乙酰化修饰在VAD致学习记忆功能障碍中的作用及机制研究

摘要

第一部分.孕期开始的VAD对成年仔鼠学习记忆功能及组蛋白乙酰化修饰的影响
　　目的：探讨从孕期开始的VAD对仔鼠成年期学习记忆功能及组蛋白乙酰化修饰的影响，以及 RA信号通路与组蛋白乙酰化修饰二者的联系。
　　方法：建立从孕期开始VAD的大鼠模型，实时监测VAN与VAD组仔鼠血清中VA浓度的变化；采用水迷宫行为学检测VAN和VAD组实验大鼠在8W龄时的学习记忆功能；用real-time PCR和western blot技术分别检测大鼠海马区RARα的基因和蛋白表达，同时用HAT活性检测法检测大鼠海马区的HAT活性，western blot技术检测乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4的蛋白表达，real-time PCR检测学习记忆基因Zif268、cFOS、FosB的基因表达，CHIP-qPCR对Ac-H3、Ac-H4在两组大鼠海马区学习记忆基因启动子区域的富集情况进行检测；进而分别用real-time PCR和western blot技术检测组蛋白乙酰转移酶CBP、p300、PCAF的基因和蛋白表达情况；最后用Co-IP和激光共聚焦技术对两组大鼠海马区RARα和CBP蛋白之间的相互作用情况进行检测。
　　结果：
　　（1）实时监测VAN与VAD组仔鼠血清中视黄醇浓度的变化：可见VAD组血清 VA浓度在生后1D、3D、7D、2W、4W、8W均明显低于 VAN对照组（p<0.001），并在8W龄进行水迷宫行为学检测：VAN组和VAD组大鼠均有学习记忆能力（p<0.001），但从孕期开始的VAD大鼠在8W龄时学习能力明显差于VAN组（p<0.05）；
　　（2）大鼠海马区RARα的基因和蛋白表达：VAD组RARα表达较VAN组显著降低（p<0.01/0.001）；
　　（3）大鼠海马区HAT活性、乙酰化组蛋白表达：VAD组大鼠海马区的 HAT活性、乙酰化组蛋白表达显著降低（p<0.05/0.001）；大鼠海马区学习记忆基因表达：VAD组大鼠海马学习记忆基因（Zif268、cFOS、FosB）表达显著降低（p<0.01/0.05）；并且富集在记忆相关基因启动子区域的乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4蛋白水平亦显著降低（p<0.01/0.05）；
　　（4）组蛋白乙酰转移酶（CBP、p300、PCAF）的基因和蛋白表达：VAD组CBP、p300的基因水平显著低于VAN组（p<0.01/0.05），PCAF在两组间无显著差异（p=ns）；CBP蛋白水平在VAD组表达显著低于VAN组（p<0.001），而p300、PCAF蛋白表达水平在两组间没有显著差异（p=ns）；
　　（5）海马组织Co-IP和激光共聚焦检测RARα与CBP蛋白两者之间的相互作用：Co-IP实验发现RARα与CBP蛋白之间存在蛋白-蛋白相互作用，并且这种相互作用在VAD组要显著弱于VAN组（p<0.001）；激光共聚焦实验证实VAD组的RARα与CBP蛋白在海马三个分区（CA1、CA3、DG）的表达均要明显弱于VAN组，两者之间存在共表达，并且这种共定位在VAD组也要显著弱于VAN组（p<0.001）。
　　结论：
　　（1）成功建立了从孕期开始的VAD大鼠模型，并确证了孕期开始的VAD会引起成年期大鼠学习记忆功能的障碍；
　　（2）VAD时大鼠海马区RARα的基因和蛋白表达显著降低；
　　（3）VAD严重影响了大鼠海马HAT活性、乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4以及学习记忆相关基因的表达；
　　（4）VAD时大鼠海马区组蛋白乙酰转移酶CBP、p300、PCAF表达不同程度下降，其中CBP表达严重受损，VAD时HAT活性、Ac-H3、Ac-H4表达以及学习记忆相关基因表达的下降可能与CBP表达的下降密切相关；
　　（5）VAD引起RA信号通路和组蛋白乙酰化修饰的显著改变，大鼠海马区RARα和CBP表达均显著降低，二者之间存在相互作用，并且这种相互作用在VAD组也显著低于VAN组。RARα和CBP相互作用异常可能在VAD所致学习记忆功能障碍中起重要作用。
　　第二部分.RARα介导的RA信号通路对学习记忆相关的CBP依赖性组蛋白乙酰化修饰作用的调控机制
　　第一章:RARα对学习记忆相关的组蛋白乙酰化修饰作用的调控机制
　　目的：研究激活或抑制RARα介导的RA信号通路对CBP、HAT活性、乙酰化组蛋白以及学习记忆相关基因表达的影响。
　　方法：培养胎鼠原代海马神经元，于培养的第六天用NSE做标记对神经元纯度进行鉴定。设定①RFP、②RFP+RA、③RA+siRARα、④RA+Ad-RARα四个组，于培养的第六天，分别加入相应的RA或RFP、siRARα、Ad-RARα的重组腺病毒进行干预，于培养的第七天采用Real-time PCR分别检测RARα、CBP、记忆相关基因的mRNA水平；CHIP-qPCR检测四个组神经元中RARα在CBP启动子上的富集情况；于培养的第九天检测各组的HAT活性，CBP、Ac-H3、Ac-H4的蛋白表达。
　　结果：
　　（1）胎鼠原代海马神经元生长情况良好、胞体饱满，突触逐渐增长、形成相互连接，经NSE免疫荧光鉴定，NSE阳性率>90％，纯度满足实验要求；
　　（2）经RA处理后，RARα的基因和蛋白水平显著增高，RA+siRARα腺病毒作用后的神经元中RARα基因和蛋白表达水平显著低于RFP+RA组，经RA+Ad-RARα腺病毒处理后，RARα的mRNA和蛋白表达均达到最高，显著高于RFP+RA组（p<0.001/0.01）；
　　（3）CBP基因（p<0.001/0.01/0.05）和蛋白表达、HAT活性（p<0.001/0.01/0.05）、乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4表达、记忆相关基因表达在四个组的表达趋势均同RARα的变化趋势基本一致，即RFP+RA组的表达水平显著高于RFP组与RA+siRARα组，而显著低于RA+Ad-RARα腺病毒处理组；
　　（4）RARα富集在CBP启动子区域，并且富集的水平与RARα的表达趋势基本一致（p<0.001/0.01/0.05）。
　　结论：
　　（1）成功培养并鉴定了符合实验要求的胎鼠原代海马神经元；
　　（2）获得了满足实验需求的相应的上调或下调的RARα信号；
　　（3）RARα能够调控HAT活性、乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4和下游学习记忆相关基因的表达；
　　（4）RARα不仅能够招募CBP成为辅激活子，还能直接调控CBP的表达水平，参与RA信号通路调控学习记忆基因的表达。
　　第二章:RARα介导的RA信号通路调控学习记忆相关信号中的CBP依赖性组蛋白乙酰化修饰机制
　　目的：研究CBP信号对组蛋白乙酰化调控的特异性，以及其在RARα介导的RA信号通路调控学习记忆相关信号中的作用机制。
　　方法：培养胎鼠原代海马神经元，于培养的第六天，设定（1）①NC、②siCBP两组；（2）③Ad-RARα+NC、④Ad-RARα+siCBP/C646两组；（3）⑤RFP+NC、⑥RFP+RA+NC、⑦RFP+NC+siCBP三组。首先利用（1）中两个组别对四种 siCBP慢病毒（GR805/GR806/GR807/GR808）进行筛选和鉴定，选出具有最佳抑制效率和功能的 siCBP慢病毒，然后在（2）、（3）分组细胞中分别加入相应的RA、腺病毒、慢病毒或抑制剂进行干预，于培养的第七天采用Real-time PCR分别检测RARα、CBP、记忆相关基因的mRNA水平；于培养的第九天检测各组的HAT活性，CBP、Ac-H3、Ac-H4的蛋白表达。
　　结果：
　　（1）四种siCBP慢病毒感染原代海马神经元后CBP mRNA和蛋白表达有不同程度降低，抑制效果最佳的GR806对神经元的HAT活性及Ac-H3、Ac-H4表达均有显著抑制功能（p<0.001/0.01/0.05）；
　　（2）在用Ad-RARα将RA信号通路激活的基础上，siCBP能够特异性地将激活的CBP基因（p<0.01）与蛋白表达显著抑制下来，并且神经元中HAT活性（ p<0.05）、乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4、记忆相关基因（p<0.001/0.05）的表达亦均被显著下调；
　　（3）siCBP慢病毒作用于神经元后，CBP的基因表达显著降低（p<0.05），而RARα的基因表达未发生显著改变（p=ns）；CBP的抑制剂C646并没有使RARα的蛋白产生显著下调；
　　（4）用RA直接将RA信号通路激活后，CBP基因表达能被显著上调（p<0.05），在RA的基础上siCBP作用后，上调的CBP表达又被显著下调（p<0.05），相应地，下游乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4表达、记忆相关基因表达（p<0.01/0.05）在三个组的表达趋势均同CBP的变化趋势基本一致。
　　结论：
　　（1）筛选并验证获得了最佳抑制效率的siCBP慢病毒；
　　（2）获得了满足实验需求的相应变化的RARα、CBP信号；
　　（3）CBP能够特异性地调节神经元中HAT活性、乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4和下游学习记忆相关基因的表达；
　　（4）RARα在CBP的上游，RA信号通路对学习记忆相关信号的调节是通过RARα介导的CBP依赖性组蛋白乙酰化修饰的调控实现的。

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分 孕期开始的VAD对仔鼠学习记忆功能及组蛋白乙酰化表达的影响

1材料与方法

1.1材料

1.2 方法

2结果

2.1大鼠一般情况

2.2仔鼠生后不同时期血清维生素A水平

2.3 Morris水迷宫实验检测学习记忆能力

2.4 VAN组与VAD组海马组织RARα基因和蛋白表达水平

2.5 VAN组与VAD组海马组织HAT活性检测

2.6 VAN组与VAD组海马组织乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4表达水平

2.7 VAN组与VAD组海马组织记忆相关基因的表达水平

2.8 VAN组与VAD组海马组织中乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4富集在记忆相关基因启动子区的水平

2.9 VAN组与VAD组海马组织中组蛋白乙酰转移酶的基因与蛋白表达水平

2.10 VAN组与VAD组海马组织中RARα与CBP蛋白的相互作用

2.11 VAN组与VAD组海马组织中RARα与CBP蛋白的共定位表达

3讨论

4小结

参考文献

第二部分 RARα介导的RA信号通路对学习记忆相关的CB P依赖性组蛋白乙酰化修饰作用的调控机制

第一章 RARα对学习记忆相关的组蛋白乙酰化修饰作用的调控机制

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二章 RARα介导的RA信号通路调控学习记忆相关信号中的CB P依赖性组蛋白乙酰化修饰机制

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

文献综述: 表观遗传修饰——脑功能与RA信号之间可能的重要联系

致谢

攻读博士学位期间发表的文章及会议交流论文