基质金属蛋白酶和miR99a在卡波西样血管内皮瘤中作用机制的研究

摘要

第一部分基质金属蛋白酶和微小核糖核酸99a在卡波西样血管内皮瘤中表达情况的研究
　　目的：探讨卡波西样血管内皮瘤中（ kaposiform haemangioendothelioma， KHE）基质金属蛋白酶（ matrix metalloproteinase，MMP）和微小核糖核酸（micro ribonucleic acid， microRNA）相互作用。
　　方法：收集重庆医科大学附属儿童医院2004年至2013年间29例卡波西样血管内皮瘤病人标本。所有病例均经过病理学及临床确诊。运用免疫组化、逆转录实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白质印记(Western blot)检测KHE病人标本中MMP3、MMP7、MMP9、MMP13和微小核糖核酸99a（miR99a）的表达，使用双变量相关分析分别计算MMPs和miR99a之间的相关系数。
　　结果： KHE标本中通过免疫组化、RT-qPCR、Western blot三种方法检测到 MMP7、MMP9、MMP13的表达，但没有检测出 MMP3的表达。我们发现基质金属蛋白酶7与MiR99a的表达水平有显著意义的相关性（r=0.76;P<0.001），基质金属蛋白酶13与MiR99a的表达水平也有显著意义的相关性（r=0.81; P<0.001），而基质金属蛋白酶9的水平与MiR99a的表达水平没有相关性（r=0.0052;P=0.96）。
　　结论：基质金属蛋白酶和微小核糖核酸与卡波西样血管内皮瘤的肿瘤发生有关。卡波西样血管内皮瘤中微小核糖核酸99a与基质金属蛋白酶7和基质金属蛋白酶13有密切相关性，与基质金属蛋白酶9没有相关性。
　　第二部分微小核糖核酸99a通过调节基质金属蛋白酶7和基质金属蛋白酶13控制卡波西样血管内皮瘤的侵袭性的研究
　　目的：进一步探索基质金属蛋白酶7和基质金属蛋白酶13通过微小核糖核酸99a调节来控制卡波西样血管内皮瘤的侵袭性的分子机制。
　　方法：使用含20％的胎牛血清的DMEM培养基培养一种人的卡波西样血管内皮瘤的细胞系（SLK）。再分别使用含有过表达的 miR99a的质粒和小分子干扰RNA转染SLK细胞，48小时后通过RT-qPCR检测鉴定miR99a表达情况。通过RT-qPCR、Western blot、酶联免疫吸附法（ELISA）检测miR99a高表达（SLK-miR-99a）和低表达的SLK细胞（SLK-ShmiR-99a）基质金属蛋白酶7、基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶13的表达，利用Transwell细胞体外侵袭实验观察miR99a高表达和低表达的SLK细胞侵袭性的变化。在miR99a敲除的SLK细胞（SLK-ShmiR-99a）中分别使用 PI3k/Akt信号通路阻断剂 LY294002和ERK/MAPK信号通路阻断剂 PD98059进行干扰，通过RT-qPCR、Western blot、酶联免疫吸附法（ELISA）检测miR99a敲除的SLK细胞基质金属蛋白酶7和基质金属蛋白酶13的表达。利用Transwell细胞体外侵袭实验观察信号通路阻断剂 LY294002和PD98059对miR99a敲除的SLK细胞侵袭能力的影响。
　　结果：通过RT-qPCR检测证明SLK-miR-99a中miR99a表达明显高于正常SLK细胞（p<0.05），而SLK-ShmiR-99a中miR99a表达明显低于正常SLK细胞（p<0.05）。通过RT-qPCR, Western blot和ELISA实验我们发现SLK-miR-99a细胞中MMP7和MMP13的表达明显低于SLK-N细胞（p<0.05），SLK-ShmiR-99a细胞中MMP7和MMP13的表达明显高于SLK-N细胞（p<0.05），而三种细胞的MMP9表达无明显差异性（p＞0.05）。通过Transwell细胞体外侵袭实验发现SLK-miR-99a实验组侵袭性明显小于 SLK-N实验组（p<0.05），而 SLK-ShmiR-99a实验组侵袭性明显强于SLK-N实验组（p<0.05）。通过RT-qPCR、Western blot和ELISE实验发现SLK-ShmiR-99a+ LY294002实验组SLK细胞MMP7的表达明显低于SLK-ShmiR-99a细胞（p<0.05），MMP13的表达与 SLK-ShmiR-99a细胞无明显差异（p＞0.05）；SLK-ShmiR-99a+PD98059实验组SLK细胞MMP13的表达明显弱于SLK-ShmiR-99a细胞（p<0.05），MMP7的表达与SLK-ShmiR-99a细胞无明显差异（p＞0.05）。Transwell细胞体外侵袭实验发现 SLK-ShmiR-99a+ LY294002和 SLK-ShmiR-99a+ PD98059实验组 SLK细胞的侵袭能力都弱于SLK-ShmiR-99a（p<0.05），而他们之间比较无显著性差异（p＞0.05）。
　　结论：SLK细胞中微小核糖核酸99a通过调控基质金属蛋白酶7和基质金属蛋白酶13影响KHE的侵袭性，而基质金属蛋白酶9似乎不受微小核糖核酸99a的调控。PI3k/Akt信号通路的抑制可以显著消除微小核糖核酸99a的敲除对基质金属蛋白酶7的影响，但不能消除对基质金属蛋白酶13的影响，相反ERK/MAPK信号通路的抑制可以显著消除微小核糖核酸99a的敲除对基质金属蛋白酶13的影响，但不能消除对基质金属蛋白酶7的影响。因此，微小核糖核酸99a、MMP7和MMP13有望成为治疗卡波西样血管内皮瘤的令人期待的治疗靶点。

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前言

第一部分 基质金属蛋白酶和微小核糖核酸99a在卡波西样血管内皮瘤中表达情况的初步研究

1材料与方法

2结果

3讨论

第二部分 基质金属蛋白酶7和基质金属蛋白酶13通过微小核糖核酸99a调节来控制卡波西样血管内皮瘤的侵袭性的体外实验

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

文献综述: 卡波西样血管内皮瘤的诊治进展

致谢

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