Exenatide通过p38MAPKγ途径调节2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注能量代谢模式

摘要

第一部分：Exenatide对正常SD大鼠心肌缺血/再灌注心功能及底物选择的影响
　　目的：探讨胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)类似物艾塞那肽(Exenatide,Ex)对缺血再灌注(Ischemia/reperfusion, I/R)后正常SD大鼠心功能保护作用及对膜上葡萄糖（Glucose,Glu）、游离脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)转运载体的调节作用及和p38MAPK信号途径的关系。
　　方法：建立正常SD(Sprague Dawley)大鼠心肌I/R模型。Western blot检测 Exenatide对 I/R前后心肌细胞内 p38MAPKα（p38α）、p38MAPKγ（p38γ）亚基的表达情况；以腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)构建SiRNA(small/short interfering RNA)载体，直接心肌内注射下调心肌内 p38α、p38γ表达。冰冻切片观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表达情况，Q-PCR、Western-blot测定p38α， p38γ表达降低情况；将上述模型结合，动脉导管技术检测各组心功能变化，测量左室内压上升/下降最大速率（± Maximal rate of left ventricular pressure development，±LVdp/dt max，），左室舒张末压（Left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP），左室收缩压（Left ventricularsystolic pressure，LVSP）；Western-blot检测胞膜上和胞浆内葡萄糖转运蛋白1(Glucose transporter1,GLUT-1)，葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporter4,GLUT-4)，脂肪酸转位蛋白FAT/CD36的表达；间接免疫荧光测定胞膜和胞浆内GLUT-1，GLUT-4，FAT/CD36的表达。
　　结果：①I/R可增加心肌细胞内p38γ表达，Exenatide预处理可增强此效应（P＜0.05），单独使用Exenatide不能增加p38γ表达。p38α表达水平无变化。②冰冻切片可见到均匀明亮的绿色荧光；与AAV-GFP组相比，AAV-p38α组的p38α亚基在mRNA、蛋白水平显著降低，p38γ亚基表达水平无变化；AAV-p38γ组的p38γ亚基在mRNA、蛋白水平显著降低（P＜0.05），p38α亚基表达水平无变化；③ Exenatide预处理改善了I/R对心肌的损伤，表现为：±LV dp/dt max、LVSP增加， LVEDP降低（P＜0.05）；该保护效应在AAV-GFP、AAV-p38α组存在， AAV-p38γ组消失了（P＜0.05）;④和I/R组相比，Exenatide预处理增加了心肌细胞膜上的 GLUT-1表达，且在胞浆内的表达也增加了；该效应在AAV-GFP、AAV-p38α组存在，AAV-p38γ组消失了（P＜0.05）;⑤和I/R组相比，Exenatide预处理增加了心肌细胞膜上的GLUT-4向胞浆内易位，该效应在 AAV-GFP、AAV-p38α组存在，AAV-p38γ组消失了（P＜0.05）;⑥和I/R组相比，Exenatide预处理显著增加了心肌细胞膜上的FAT/CD36向心肌细胞胞浆的易位；该效应在AAV-GFP、AAV-p38α组存在，AAV-p38γ组消失了（P＜0.05）;⑦间接免疫荧光进一步证实了上述结论，表现为：Sham组中GLUT-1在细胞膜上有微弱表达，I/R后膜上红色荧光增强，Exenatide预处理增加了这一效应，且伴胞内的红色荧光表达增加;GLUT-4在Sham组中主要表达于细胞质内，I/R后细胞膜上红色荧光显著增强，细胞质内红色荧光显著减少，而Exenatide预处理增加了这一效应;FAT/CD36在Sham组中强烈表达于细胞膜上，I/R后细胞膜上红色荧光减弱，细胞质内红色荧光增加，而Exenatide预处理增加了这一效应。以上效应在AAV-p38α、AAV-GFP组中依然存在，但在AAV-p38γ组中消失了
　　结论：①I/R及联合使用Exenatide可增加正常SD大鼠心肌内p38γ蛋白表达，但单独使用Exenatide无此效应；②心肌内直接注射AAV可有效下调p38α和p38γ基因表达，是实现动物基因表达调节的良好工具；③Exenatide可优化正常大鼠心脏 I/R后能量代谢底物的选择；④对能量代谢底物选择的优化可改善正常大鼠心脏I/R后左心功能；⑤p38γMAPK信号途径在这一调节效应中起着关键作用。
　　第二部分Exenatide对2型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注能量代谢模式的影响
　　目的：探讨Exenatide对2型糖尿病大鼠心肌I/R时心功能及细胞膜上Glu、FFA转运载体、细胞内能量代谢酶及代谢底物的影响。
　　方法：建立2型糖尿病（T2DM）模型，不同剂量（3、6、10ug/kg） Exenatide处理3周，观察其体重及血糖变化，筛选出降低血糖且不影响体重变化的剂量;Exenatide预处理后建立I/R模型，动脉导管技术检测左心功能；小动物PETCT检测心脏Glu摄入量；Western-blot测定膜上GLUT-1，GLUT-4, FAT/CD36，单羧酸转运蛋白-1（monocarboxylate transporter1，MCT-1）水平;ELISA测定心肌细胞内能量代谢相关酶及FFA水平：中链酰基辅酶 A脱氢酶（ Medium ChainAcyl-CoA Dehydrogenase， MCAD）、肉碱脂酰转移酶1（ Carnitine palmityl transferaseⅠ，CPT-1）、6-磷酸果糖激酶-1（6-phosphofructokinase1， PFK-1）;蒽醌法测定糖原（glycogen，Gn）水平。
　　结果：①和saline组相比，Exenatide6 ug/kg可降低血糖水平（P＜0.05），且不伴明显体重变化，以此作为后续实验的适宜用药剂量；②与DM组相比， Exenatide预处理改善糖尿病大鼠心功能，表现为± LV dp/dt max、LVSP的增加及LVEDP的减少；与DM+I/R组相比， Exenatide预处理组心功能有所改善，表现为±LV dp/dt max、LVSP的增加及LVEDP的减少（P＜0.05）；③与DM组相比，Exenatide预处理提高了糖尿病大鼠心脏葡萄糖摄入量，对I/R后的心脏葡萄糖摄入也有显著提高作用（P＜0.05）；④与DM组相比，Exenatide预处理可促进心肌细胞膜上GLUT-1，GLUT-4表达，抑制FAT/CD36表达；与DM+I/R组相比， Exenatide预处理还增加了 I/R后膜上的 GLUT-1，GLUT-4表达，抑制FAT/CD36表达（P＜0.05）；⑤与DM组相比， Exenatide预处理未能促进心肌细胞膜上的乳酸转移载体MCT-1表达（P＞0.05），但与DM+I/R组相比，增加了I/R后膜上的MCT-1表达（P＜0.05）；⑥与DM组相比，Exenatide预处理抑制了心肌细胞内FFA代谢的关键酶CPT-1和MCAD表达（P＜0.05）；与DM+I/R组相比，Exenatide预处理增加了I/R后胞内的PFK-1表达，抑制了CPT-1和MCAD表达（P＜0.05）；⑧与DM组相比， Exenatide预处理降低了心肌细胞内的Gn和FFA蓄积；与DM+I/R组相比，Exenatide预处理降低了I/R后心肌细胞内的Gn和FFA蓄积（P＜0.05）。
　　结论：①Exenatide预处理正向调节T2DM大鼠心脏Glu代谢：增加心脏 Glu摄入量；促进 GLUT-4、GLUT-1向胞膜易位；降低了 Gn的蓄积；③Exenatide预处理负向调节T2DM大鼠心肌细胞FFA代谢：促进FAT/CD36向胞内易位，降低了CPT-1、MCAD-1表达和FFA蓄积；④除此之外，Exenatide预处理还促进T2DM大鼠I/R损伤后细胞内PFK-1活性及膜上CPT-1表达，增加糖酵解的同时增加乳酸盐外排，降低 I/R时细胞内环境的 PH值；⑤能量模式的双重调节实现了对T2DM大鼠I/R时心脏功能的保护作用。
　　第三部分Exenatide调节糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注能量代谢模式的机制
　　目的：探讨Exenatide对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时能量代谢模式调节的机制。
　　方法：建立T2DM模型。心肌内直接注射AAV，下调p38α，p38γ亚基表达。6 ug/kg Exenatide预处理后建立I/R模型。动脉导管技术检测左心功能；小动物 PETCT检测心脏葡萄糖摄入量；Western-blot测定Glu转运载体GLUT-1，GLUT-4,脂肪酸转运载体 FAT/CD36，乳酸转移蛋白 MCT-1水平; ELISA测定心肌细胞内能量代谢相关酶（CPT-1、MCAD、PFK-1）及 FFA水平;蒽醌法测定心肌细胞内 Gn水平。
　　结果：①与 DM+I/R+Exenatide组相比， Exenatide预处理对AAV-p38MAPKα及AAV-GFP组心功能仍有改善作用，但这一作用在AAV-p38MAPKγ组消失了（P＜0.05）；②与 DM+I/R+Exenatide组相比，Exenatide预处理增加了AAV-p38MAPKα及AAV-GFP组I/R损伤后心脏 Glu摄入量，但这一作用在 AAV-p38MAPKγ组消失了（P＜0.05）；③与 DM+I/R+Exenatide组相比， Exenatide预处理增加了AAV-p38MAPKα及 AAV-GFP组 I/R后心肌细胞膜上的 GLUT-1， GLUT-4, MCT-1表达，抑制了 FAT/CD36表达，但这一作用在AAV-p38MAPKγ组消失了（P＜0.05）；④与 DM+I/R+Exenatide组相比，Exenatide预处理增加了AAV-p38MAPKα及AAV-GFP组I/R后心肌细胞内 PFK-1表达，抑制了 CPT-1，MCAD表达，但这一作用在AAV-p38MAPKγ组消失了（P＜0.05）；⑥与 DM+I/R+Exenatide组相比，Exenatide预处理减少了AAV-p38MAPKα及AAV-GFP组I/R后心肌细胞内Gn和FFA蓄积，但这一作用在AAV-p38MAPKγ组消失了（P＜0.05）。
　　结论：Exenatide对2型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注能量代谢模式调节作用可能与激活p38MAPKγ信号通路有关。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

（一）心肌能量代谢基本情况

（二）从“利用FFA为中心”到“利用Glu为中心”---心肌能量代谢模式的调节

（二）GLP-1及其类似物的心血管保护作用及国内外研究现状

（二）p38MAPK在心肌能量代谢中的作用

第一部分：Exenatide对正常SD大鼠心肌缺血/再灌注时心功能及底物选择的影响

1材料与方法

2结果

3 讨论

小结

第二部分Exenatide对2型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注能量代谢的影响

1材料与方法

2结果

3 讨论

小结

第三部分Exenatide调节2型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注能量代谢机制研究

1 材料与方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

全文总结

文献综述:GLP-1类似物的心血管保护作用

致谢

攻读博士学位期间发表论文