microRNA-155在骨骼肌中的功能及机制研究

摘要

研究背景：骨骼肌是人体最大的组织，负责随意运动的产生和姿势的维持。骨骼肌在人体中发挥着重要的功能，其发育、生理稳态及再生等生物学过程都需要有效而合理的调控。microRNA（miRNA）是一类长度约22个核苷酸序列的微小非编码RNA，在动植物基因组里具有极其保守的基因序列。miRNA在转录后通过与目的mRNA的结合，促进mRNA的降解和/或抑制其翻译，从而在转录后水平对目的基因发挥负调控的作用。近年来，通过运用基因敲除或转基因技术对miRNA体内功能的研究，人们已经发现miRNA在骨骼肌的发育及病理生理等过程发挥着广泛的调节作用。同时，miRNA在许多骨骼肌疾病中表达异常，但其中的功能和机制仍然没有完全弄清楚。因此，系统研究miRNA在骨骼肌生理及病理条件下的功能和机制，不仅有助于拓展骨骼肌的基础生物学知识，也有利于为骨骼肌疾病的治疗提供新的研究方向。miRNA-155（miR-155）是产生于B-cell Integration Cluster(BIC)基因的miRNA，是最早使用基因敲除模型来研究其体内功能的miRNA之一。miR-155在免疫系统、造血系统、心血管系统及肿瘤等病理生理过程发挥重要作用，但 miR-155在骨骼肌中的功能和机制目前并不清楚。
　　目的：本课题运用 miR-155基因敲除小鼠模型，从骨骼肌的发育及生理、骨骼肌干细胞（肌卫星细胞）和骨骼肌的再生等三方面，系统研究miR-155在骨骼肌中的功能和相关机制。
　　方法：
　　1.以 miR-155基因敲除型和野生型小鼠为实验对象，通过组织切片，免疫组织化学染色，RT-qPCR等方法，观察在正常生理情况下基因敲除miR-155对骨骼肌发育及生理稳态的影响；
　　2.以miR-155基因敲除型和野生型小鼠为实验对象，提取成体骨骼肌单根肌纤维，观察骨骼肌肌卫星细胞数量；提取及体外培养Primary myoblast，检测其细胞增殖及成肌分化的能力；
　　3.以miR-155基因敲除型和野生型小鼠为实验对象，构建心脏毒素诱导的骨骼肌急性损伤模型，观察基因敲除 miR-155对骨骼肌再生的影响；使用MACS及FACS技术提取骨骼肌再生过程中的巨噬细胞，观察巨噬细胞的数量、类型及分布、以及相关炎症细胞因子在骨骼肌再生修复过程中的变化差异；鉴定 miR-155直接调控的靶基因及相关信号通路，明确miR-155调控骨骼肌再生的分子机制。
　　结果：
　　1.在正常的生理状态下，miR-155基因敲除小鼠的骨骼肌发育正常，骨骼肌形态、肌纤维大小及分布、肌纤维类型无明显异常；
　　2.在正常的生理状态下，miR-155基因敲除小鼠的骨骼肌干细胞（肌卫星细胞）数量、增殖及分化能力无明显异常；
　　3.在心脏毒素诱导的骨骼肌急性损伤-再生模型中，miR-155基因敲除小鼠的骨骼肌再生较野生型明显延迟；基因敲除 miR-155导致巨噬细胞的激活延迟、巨噬细胞的亚型以及细胞因子的表达失衡，最终延迟了炎症反应过程；Socs1是miR-155直接作用的靶基因，miR-155通过调节Socs1/Stat3信号通路是miR-155调控骨骼肌再生的分子机制之一。
　　结论：基因敲除 miR-155对骨骼肌的正常发育和生理、肌卫星细胞的数量及增殖分化能力无明显影响；但基因敲除 miR-155导致骨骼肌急性损伤后的再生修复延迟，miR-155调节巨噬细胞的炎症反应是骨骼肌再生调控机制的重要组成部分。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 miR-155对骨骼肌发育和生理的影响

前言

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 实验主要试剂

1.3 主要仪器

2 实验方法

2.1 miR-155 基因小鼠的繁殖

2.2 小鼠的Genomic DNA的提取

2.3 小鼠的基因型鉴定

2.4 小鼠的骨骼肌的提取和分类保存

2.5 TRIzol提取骨骼肌的Total RNA

2.6 miRNA 的检测（Taqman assay）

2.7 骨骼肌石蜡切片的制作

2.9 Fast green/Sirius red染色

2.10 骨骼肌冰冻切片的制作

2.11 Wheat germ agglutinin (WGA)染色及肌纤维面积的计算

2.12 免疫组织化学荧光染色（Laminin、Dystrophy、Fiber type）

2.13 RT-qPCR检测骨骼肌相关基因的mRNA水平

2.14 统计学方法

3 实验结果

3.1小鼠的一般情况及基因型鉴定

3.2 miR-155对骨骼肌发育的影响

3.3 成体骨骼肌中miR-155可能的靶基因的表达检测

4 讨论

参考文献

第二部分 miR-155对骨骼肌卫星细胞的影响

前言

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 实验试剂

1.3 主要仪器

2 实验方法

2.2 单肌纤维的Pax7免疫化学荧光染色

2.3 骨骼肌Pax7免疫组织化学染色

2.4 小鼠primary myoblast的提取

2.5 Primary myoblast增殖能力的检测

2.6 Primary myoblast的诱导分化

2.7 TRIzol提取细胞Total RNA

2.8 MF20免疫荧光染色

2.9 miRNA 的检测（Taqman assay）

2.10 RT-qPCR

2.11 统计方法

3 实验结果

3.1 miR-155对成体骨骼肌肌卫星细胞数量的影响

3.2 miR-155对Primary myoblast增殖及分化的影响

4 讨论

参考文献

第三部分 miR-155对骨骼肌再生的影响及机制研究

前言

第一节 miR-155对骨骼肌再生的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 小结

第二节 miR-155对骨骼肌再生中巨噬细胞介导的免疫炎症反应的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4小结

第三节 miR-155的靶基因鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 小结

讨论

参考文献

qPCR引物表

全文总结

文献综述:非编码RNA对骨骼肌发育和疾病的调控

致谢

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