GSK-3β在神经元氧糖剥夺/复氧时对Nrf2活性的调控作用

摘要

背景：氧化应激是脑缺血再灌注损伤的核心病理环节。脑缺血再灌注时，体内抗氧化酶失活和抗氧化剂不足以清除过量自由基，体内氧化系统清除能力出现失衡，引起氧化应激损伤，最终导致神经元的死亡。研究表明内源性抗氧化系统与Nrf2/ARE通路密切相关。GSK-3β是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种，有文献报道在鼠的Hepa-1细胞和人的 HEK293T细胞中GSK-3β对Nrf2具有调控作用。然而GSK-3β在神经元氧糖剥夺/复氧时候对Nrf2的是否具有调控，目前还未见明确的报道。
　　目的：探讨GSK-3β在神经元氧糖剥夺/复氧时对Nrf2活性的调控作用。
　　方法：（1）原代神经元的培养及细胞免疫荧光鉴定神经元纯度。（2）构建四条GSK-3β干扰慢病毒（GSK-3βsiRNA）和一条GSK-3β过表达慢病毒（GSK-3β），感染神经元，在倒置荧光显微镜下观察细胞形态和感染效率，通过Western blot和qRT-PCR筛选出干扰效果最佳的慢病毒片段和检测过表达慢病毒片段的过表达效果。（3）建立稳定的OGD/R模型，OGD1.5小时后，恢复氧气和糖再培养0.5、1、4、6小时，通过Western blot检测β-catenin，GSK-3β，p-GSK-3β（tyr216)， Nrf2蛋白表达，选择合适复氧时间建立模型。（4）添加GSK3-β抑制剂SB216763和LiCl。（5）正常情况下，通过Western blot检测神经元GSK-3β、p-GSK-3β（tyr216)、Nrf2、核Nrf2的蛋白水平和qRT-PCR检测GSK-3β，Nrf2 mRNA水平。观察GSK-3β与Nrf2的关系。（6）神经元OGD/R后通过Western blot检测GSK-3β、p-GSK-3β（tyr216)、Nrf2、核Nrf2的蛋白水平和qRT-PCR检测GSK-3β、Nrf2 mRNA水平。观察GSK-3β与Nrf2的关系。（7）EMSA检测Nrf2/ARE的结合活性。（8）神经元OGD/R后通过Western blot检测HO-1、NQO1的蛋白水平和qRT-PCR检测HO-1、NQO1mRNA水平。
　　结果：（1）细胞免疫荧光检测神经元纯度在90％以上。（2）倒置荧光显微镜下观察神经元中GSK-3β干扰和过表达慢病毒的感染率以及结合细胞生存状态，选择慢病毒合适的MOI值为20。（3）Western blot和qRT-PCR检测结果提示，转染GSK-3β干扰慢病毒969片段后，细胞的GSK-3β蛋白水平和mRNA表达降低最明显。转染GSK-3β过表达慢病毒片段后，细胞的GSK-3β蛋白水平和mRNA表达明显升高。（4） Western blot检测结果提示OGDR1.5小时/R1小时p-GSK-3β(tyr216)浓度达到最高，选取R1小时为后续实验条件。（5）Western blot， qRT-PCR，EMSA检测结果提示，在正常状态下GSK-3β对Nrf2无明显调控作用。在神经元OGD/R后GSK-3β对Nrf2、Nrf2与ARE的结合活性、Nrf2/ARE下游基因HO-1、NQO1有明显负性调控作用。
　　结论：神经元OGD/R后，GSK-3β对Nrf2, Nrf2/ARE结合活性以及Nrf2/ARE通路下游基因HO-1、NQO1具有负性调控作用。