HBV相关性肝癌中HBV cccDNA突变位点的研究

摘要

目的:研究乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染导致的肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC）患者共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的表达水平及各区间位点的变异,探讨HBV cccDNA不同区域核苷酸位点突变与HCC疾病的关系。基于基因表达谱数据筛选HBV感染的HCC疾病关键基因因子，为基因靶向性预防和治疗肝癌提供参考因子。
　　方法：收集49例重庆医科大学附属第一和第二医院HBV感染形成的HCC患者的血清及肝脏癌组织和配对的癌旁组织，首先检测患者临床病毒学指标，再用特异性荧光定量Tag Man探针方法检测肝组织内HBV cccDNA和DNA在HCC癌组织及癌旁组织中的表达水平；然后利用滚环扩增（Roling circle amplification,RCA）技术特异性扩增癌组织及癌旁组织中肝脏内的 cccDNA。进一步分析患者癌组织和癌旁组织HBV cccDNA和 DNA表达水平的差异及cccDNA在X区和前C/C区核苷酸突变位点及突变组合与HCC发生的关系；下载Gene Expression Ominibus(GEO)数据库中5对HBV感染的HCC配对样本基因表达谱数据，通过生物信息学分析方法筛选与HCC直接关联的关键候选因子。
　　结果：（1）在49对HCC病人中，共有35例配对的癌组织和癌旁组织的cccDNA有效检测，cccDNA在癌组织中总体表达水平显著低于对应的癌组织（5.20 VS.9.35 copiesy/cell，p=0.0033）；配对的癌组织和癌旁组织的cccDNA经过RCA扩增后，在X和preC/C区分别有18对和16对能有效扩增，cccDNAX区域位点突变率在癌组织中显著高于癌旁组织（28.63％和20.94%，p=0.0313）；序列比对后发现X区T1721G位点和preC/C区域A1979G的突变在HCC癌组织中发生的个数显著地高于癌旁组织（p=0.04075，OR=10.1598；p=0.0155，OR=13.7529）；由T1727G突变形成的组合突变A1703G/T1727G、A1762T/G1764A/T1727G、A1703G/T1727G/A1762T/G1764A， A1979G突变形成的组合突变 A1979G/A2189、A1979G/A2189C/T/C2288A、A1979G/A2189C/T/C2288A/A2075T在癌组织中发生的次数高于癌旁组织。
　　(2)筛选得到的高风险肝癌模块中（75%）过量表达基因EGR1, FOS, DUSP1，且共同参与MAPK信号通路和下游通路细胞周期调控。
　　结论：既往文献报道的HCC中的典型突变位点A1762T/G1764A、G1896A/G1899A等在本研究的样本中cccDNA的X区间和preC/C区间在癌组织和癌旁组织中均有突变，且无明显差别;发现的T1721G和A1979G单核苷酸突变及组合位点突变更具有特征性，它们的突变可能与HBV感染的HCC疾病的发展关联密切。筛选得到的EGR1, FOS, DUSP1基因很可能成为早期识别HCC的生物标志，同时也为基因靶向性治疗HCC提供了候选因子。