呼吸机相关性肺炎新生儿气管导管生物膜菌群及其相互作用研究

摘要

第一部分呼吸机相关性肺炎新生儿气管导管生物膜菌群分析
　　目的：气管导管生物膜是呼吸机相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia, VAP)?发生的重要危险因素。本研究旨在对机械通气新生儿气管导管生物膜菌群进行分析，以探讨VAP发生相关的生物膜细菌。
　　方法：收集重庆医科大学附属儿童医院2014年1月31日至2015年1月31日诊断为呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome, NRDS)和肺炎的机械通气48小时以上的新生儿的气管导管标本。对气管导管生物膜细菌DNA进行提取，并扩增16s rRNA基因V3-V4区，进行Miseq测序。将测序得到的原始数据进行拼接、质控获得有效序列，计算覆盖度指数及绘制稀释曲线来评价Miseq测序深度与覆盖度。分析并计算菌群多样性指数，同时根据97％的相似水平将序列划分为不同的可操作分类单元(operational taxonomy unit, OTU)，进行OTU分析得到细菌种属信息。
　　结果：基于Miseq测序和生物信息学研究发现机械通气新生儿气管导管生物膜均为多种细菌共存，且菌群多样性明显。不同基础疾病的患儿气管导管生物膜菌群多样性及组成存在明显差异(P<0.05)。Spearman相关性分析显示气管导管生物膜上链球菌的检出可能与VAP的发生具有相关性(P<0.05)。虽然差异没有达到统计学意义(P>0.05)，但是导管生物膜链球菌的检出者所需机械通气时间更长，白细胞水平更低。
　　结论：链球菌属在VAP新生儿气管导管生物膜中检出率明显升高，提示其可能与VAP的发生具有一定相关性。
　　第二部分呼吸机相关性肺炎新生儿气管导管生物膜菌群与咽拭子、导管吸取物菌群关系研究
　　目的：出于对患儿安全的考虑，无法取得机械通气过程中的气管导管标本，使得在机械通气过程中特别是怀疑发生VAP时的导管生物膜菌群无法获知，需要寻找其他类型标本来代表导管生物膜菌群。
　　方法：同时收集重庆医科大学附属儿童医院2014年1月31日至2015年1月31日诊断VAP的新生儿气管导管、咽拭子及导管吸取物标本。对以上三种类型标本进行细菌DNA提取，扩增16s rRNA基因V3区，进行变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)。根据DGGE图谱以进行菌群多样性及聚类分析。对DGGE条带进行切割克隆测序，将序列与GenBank比对，获得细菌种属信息。比较三种类型标本菌群多样性及组成特征。
　　结果：合并有VAP的机械通气新生儿导管生物膜细菌多样性与相应的导管吸取物标本类似，而与咽拭子标本存在明显差异(P<0.05)。导管生物膜、咽拭子及导管吸取物标本总体细菌构成存在明显差异(P<0.05)。导管吸取物标本葡萄球菌的检出能很好的预测其在导管生物膜的存在，灵敏度为85.7%，特异度为83.3%。咽拭子中假单胞菌属的检出对预测其在导管生物膜中的存在有一定的帮助，特别是在早发VAP患者中灵敏度为60.0%，特异度为100%。
　　结论：虽然不能完全反映出导管生物膜的菌群情况，但是运用咽拭子及导管吸取物的细菌检测可以帮助预测相应导管生物膜细菌，特别是VAP致病菌如葡萄球菌属和假单胞菌属，所以其在VAP的疾病监控中具有一定的应用价值。
　　第三部分导管生物膜链球菌的分离鉴定及其对铜绿假单胞菌生物膜形成影响的体外研究
　　目的：进一步分离及鉴定导管生物膜临床链球菌，并探讨其对VAP常见致病菌铜绿假单胞菌生物膜形成的影响。
　　方法：收集重庆医科大学附属儿童医院2014年1月31日至2015年1月31日诊断VAP的新生儿气管导管标本。对气管导管生物膜进行细菌培养，根据菌落形态、革兰染色及接触酶试验初步鉴定出链球菌，进一步提取细菌DNA进行链球菌管家基因扩增并测序。将序列结果与链球菌数据库比对，MEGA6绘制进化树了解临床链球菌种属信息。将其与铜绿假单胞菌PAO1(ATCC BAA-47)进行共培养生物膜，并与铜绿假单胞菌PAO1单独培养的生物膜对比，比较生物膜形成情况及铜绿假单胞菌群体感应系统关键基因lasI，lasR，rhl，rhlR和藻酸盐形成关键基因aglD的表达。
　　结果：在所有导管生物膜标本中，分离到一株链球菌，经过进化树亲缘分析鉴定为血链球菌。其可促进铜绿假单胞菌PAO1生物膜的形成，并可促进铜绿假单胞菌PAO1的生长。临床血链球菌显著上调铜绿假单胞菌PAO1群体感应las及rhl系统关键基因，及藻酸盐合成关键基因的表达(P<0.05)。
　　结论：临床分离血链球菌可促进VAP致病菌铜绿假单胞菌生物膜的形成，这可能在VAP的致病中起到一定作用。
　　第四部分导管生物膜链球菌临床分离株及铜绿假单胞菌混合培养生物膜对人肺上皮细胞的影响
　　目的：探讨临床分离链球菌与铜绿假单胞菌共培养生物膜对人肺上皮细胞活性及炎症因子释放的影响。
　　方法：分别将临床分离链球菌和铜绿假单胞菌PAO1共培养生物膜培养液、铜绿假单胞菌PAO1生物膜培养液及临床分离链球菌生物膜的培养液干预BEAS-2B肺上皮细胞(ATCC9609)。干预24小时后，显微镜下观察不同处理组细胞的变化， CCK-8检测细胞活性， Hochest/PI进行细胞凋亡与坏死染色。并在处理1、3、6、9、12和24小时后分别收集不同生物膜培养液干预组的细胞上清液，ELISA检测IL-8水平。
　　结果：临床血链球菌与铜绿假单胞菌共培养生物膜对BEAS-2B细胞的活性损伤明显小于铜绿假单胞菌单独培养生物膜(P<0.05)。ELISA检测结果说明，干预3小时后IL-8达到最高峰，且共培养组IL-8水平低于铜绿假单胞菌单独培养生物膜组(P<0.05)。
　　结论：临床血链球菌可能参与调控宿主对铜绿假单胞菌生物膜感染的固有免疫反应。