小鼠绿脓杆菌和仙台病毒LAMP检测方法的建立及其初步应用

摘要

实验动物是生命科学研究中最基本的四大支撑要素之一，动物实验科学研究的重复性和准确性要有实验动物的质量作保障。在现代医学研究和生命科学研究中，小鼠是最常用的实验动物，其微生物质量将直接影响实验结果的准确性。
　　根据 GB14922.2-2011规定，小鼠绿脓杆菌（ Pseudomonas aeruginosa，PA）是无特定病原体（ specific pathogen free animal，SPF）实验小鼠的必须检测的项目之一；仙台病毒（Sendai virus，SeV）是清洁级实验小鼠的必须检测的项目之一。目前，已经报道的检测小鼠绿脓杆菌和仙台病毒的方法有：分离培养、RT-PCR、酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunoabsorbent Assay，ELISA）等。传统的分离培养方法准确性高，但该方法操作繁琐、费力、耗时，且检出率低，易出现假阴性。RT-PCR和 ELISA检测方法灵敏度高，但该方法对仪器要求较高，易出现假阳性。
　　本研究应用环介导等温扩增技术（ Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），分别根据小鼠绿脓杆菌和仙台病毒基因组的高度保守序列，采用PrimerExpler V4软件设计LAMP的6条特异性引物，通过优化其反应体系条件，分别建立了小鼠绿脓杆菌LAMP检测方法和小鼠仙台病毒LAMP检测方法，并对其方法的特异性、稳定性、重复性、灵敏度依次进行验证，且初步应用于临床检测。
　　本研究主要有两部分组成。
　　第一部分小鼠绿脓杆菌LAMP检测方法的建立及其初步应用
　　目的：建立一种实验小鼠绿脓杆菌（PA）的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。方法：采用环介导等温扩增（LAMP）技术，以小鼠PA的oprL基因的序列为靶基因，采用PrimerExploer V4软件设计了两套LAMP引物，其中每套引物包含6条特异性序列，应用DNA提取试剂盒提取PA DNA，通过优化LAMP反应体系条件建立小鼠PA特异性的LAMP检测方法(PA/LAMP)。同时，对该方法的特异性、稳定性、重复性、灵敏度进行验证，并初步应用于临床检测。结果：所建立的PA/ LAMP方法可特异性的检测出PA/ DNA，对其它常见病原体均为阴性；PA/LAMP能检测出不同批次同一时间或同一批次不同时间的PA/DNA；PA/LAMP检测PA/DNA的最低检测含量为0.29 pg，与PCR检测方法相比较，其灵敏度高约105倍；临床检测，PA的阳性率为27.7％（10/36)；全部反应可在1 h内完成；通过添加荧光染料SYBR Green I可直观目测实验结果。结论：建立的 PA/ LAMP方法，具有特异、准确、灵敏、快速、简便的特点，可用于实验小鼠PA的快速检测。
　　第二部分小鼠仙台病毒LAMP检测方法的建立及其初步应用
　　目的：建立一种实验小鼠仙台病毒（ SeV）的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。方法：采用环介导等温扩增（LAMP）技术，以小鼠SeV(gi:9627219)F蛋白的基因序列为目标基因，采用PrimerExploer V4软件设计LAMP的6条特异性引物，应用病毒RNA提取试剂盒提取SeV RNA，通过优化LAMP反应体系条件，建立小鼠SeV的LAMP检测方法(SeV/LAMP)。同时，对该方法的特异性、稳定性、重复性、灵敏度进行验证，并初步应用于临床检测。结果：所建立的SeV/LAMP方法可检测出SeV RNA，对其它常见病原体均判为阴性；SeV/LAMP能检测出不同批次同一时间或同一批次不同时间的 SeV RNA；SeV/LAMP检测SeV RNA的最低检测含量为0.33 pg，与ELISA检测方法相比较，其检出率高（分别为5/30和2/30）；临床检测，SeV的阳性率为27.5%（11/40)；全部反应可在1 h内完成；通过添加荧光染料SYBR Green I可直观目测实验结果。结论：建立的LAMP方法，具有特异、准确、灵敏、快速、简便的特点，可用于实验小鼠SeV的快速检测。

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前言

第一部分 小鼠绿脓杆菌LAMP检测方法的建立及其初步应用

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第二部分 小鼠仙台病毒LAMP检测方法的建立及其初步应用

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

全文总结

本文的创新之处：

文献综述:小鼠绿脓杆菌和仙台病毒研究进展

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