人嗅黏膜组织块培养法获取神经干细胞的研究

摘要

目的：建立并优化人嗅黏膜组织块离体培养获取神经干细胞的方法，诱导所得干细胞向神经元分化，为获取神经干细胞提供简便易行的新方法，为神经精神疾病的研究提供新的研究对象。
　　方法：局麻下，鼻内窥镜引导钳取健康成年人鼻中隔处嗅黏膜2×3cm2，置于胎牛血清中浸泡15分钟，以完全培养基（含10％胎牛血清、1%青/链霉素和89%DMEM/F12）培养嗅黏膜组织块，观察嗅黏膜组织块的细胞生长情况，培养7天后消化所得细胞按15,000cells/cm2接种，更换完全培养基为神经球诱导培养基培养，动态观察细胞的生长过程。细胞免疫荧光检测嗅黏膜组织块培养所得细胞表达神经干细胞特异标志物的情况。以神经干细胞分化培养基诱导嗅黏膜神经球分化，鉴定分化所得细胞中神经元标志物MAP2的表达，确认其可分化为神经元。
　　结果：①人嗅黏膜组织块接种于培养皿24小时后，组织块边沿见形状不一的细胞爬出，培养5天后，组织块边沿爬出的细胞不断增加且开始坏死漂浮。组织块培养8天后，见不少梭形或多角形细胞贴壁生长。大约经过两周，此类细胞麋集，可传代培养。传代后，细胞生长速度增快，约2-3天可传代1次，传代次数至少10次。②人嗅黏膜组织块培养所得细胞免疫荧光染色阳性表达nestin。③对上述细胞予以神经球诱导培养基培养两天后，细胞开始以某处为中心聚集生长，第6天后，细胞逐渐变为短梭形、椭圆形或圆形汇集成球半贴壁生长。培养12天后，见细胞呈大小不一的球体，边缘不规则，悬浮生长。培养17天后，细胞球中心变黑坏死。④以分化培养基培养神经球5天后细胞开始向两端发出突起，突起之间相互连接，并阳性表达MAP2。
　　结论：⑴经成年人嗅黏膜组织块离体培养，我们成功获得了嗅黏膜神经干细胞。这些细胞可通过诱导形成神经球以纯化、扩增。⑵来自成人嗅黏膜的神经球可分化为阳性表达MAP2的细胞，证实了成人嗅黏膜离体培养所得的神经干细胞可分化为神经元。⑶运用嗅黏膜组织块离体培养获得了嗅黏膜神经干细胞，成功地证实了人嗅黏膜组织块培养法获取神经干细胞简单易行，为今后神经精神疾病的研究提供了基础。