黏膜免疫PD-ΔA146Ply融合蛋白对小鼠流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染的保护效果及机制研究

摘要

目的:流感嗜血杆菌和肺炎链球菌是人类上呼吸道常见定植菌，能引起多种侵袭性和非侵袭性疾病。目前已上市的预防二者感染的疫苗存在覆盖血清型有限、价格昂贵、血清型替换等多种问题，因而研发新的疫苗十分必要。蛋白疫苗具有制备简便、非血清型依赖性、免疫原性强等特点，是目前最具开发潜力的一类疫苗。蛋白D（protein D，PD）是流感嗜血杆菌表面保守脂蛋白，在流感嗜血杆菌感染儿童血清中可检测到高滴度抗PD抗体，是抵御流感嗜血杆菌感染的良好疫苗候选物。ΔA146Ply是肺炎链球菌溶血素（pneumolysin，Ply）的单氨基酸突变体，其本身是较好的疫苗候选物，此外还具有黏膜佐剂的潜能，能增强相融合蛋白的黏膜应答强度。本研究拟将这两种细菌的疫苗候选蛋白融合表达，采用黏膜免疫方式评估 PD-ΔA146Ply融合蛋白对流感嗜血杆菌和肺炎链球菌两种细菌感染的保护效果，并深入探讨其相应的免疫应答机制，为新疫苗的开发提供实验室依据。
　　方法:采用分子克隆技术构建融合蛋白表达质粒，原核表达 PD、ΔA146Ply及PD-ΔA146Ply重组蛋白，镍柱亲和纯化后，采用PmB亲和层析去除蛋白中混杂的脂多糖；将纯化后重组蛋白滴鼻免疫 C57BL/6小鼠，ELISA方法检测免疫后小鼠血清及唾液中特异性IgG抗体、IgG亚型和 IgA水平，比较对照组及各免疫组间抗体应答差异；取免疫后各组小鼠脾细胞，用PD或ΔA146Ply蛋白再刺激，ELISA方法检测脾细胞培养上清中细胞因子水平以评价细胞免疫应答情况；建立小鼠流感嗜血杆菌和肺炎链球菌定植和致死性感染模型,观察各组小鼠鼻咽部细菌清除情况及生存状况以评估疫苗保护效果；采用IL-17A-/-小鼠，观察Th17型免疫应答在PD-ΔA146Ply融合蛋白黏膜免疫中抗体应答及细菌清除中的作用。
　　结果:成功构建 PD-ΔA146Ply融合蛋白表达载体，获得纯度大于90%的PD、ΔA146Ply及PD-ΔA146Ply重组蛋白，Western blot分析显示所表达蛋白能被抗His抗体识别。滴鼻免疫C57BL/6小鼠后，与对照组相比，PD-ΔA146Ply组能显著降低流感嗜血杆菌和肺炎链球菌在鼻咽部的定植（p=0.002和p=0.004），且优于单独PD组或ΔA146Ply组（p=0.045和p=0.005）。PD-ΔA146Ply免疫能有效抵御致死性流感嗜血杆菌感染（生存率为64%）（p=0.033），与单独 PD组相当;PD-ΔA146Ply免疫也能诱导抵抗致死性肺炎链球菌感染（生存率为55%）（p=0.048），且较单独ΔA146Ply组（生存率为36%）有所提高。与单独PD组相比，PD-ΔA146Ply能诱导更高滴度的抗PD IgG和sIgA（p=0.029和 p=0.041），其诱导的 IgG亚型主要为 IgG1、IgG2a及IgG2b。与单独ΔA146Ply组相比，其诱导的抗ΔA146Ply IgG和sIgA无显著性差异，但IgG2a及IgG2b滴度升高（p=0.0265）；PD-ΔA146Ply黏膜免疫野生鼠后能诱导脾细胞IL-17A分泌升高。IL-17A缺陷小鼠免疫 PD-ΔA146Ply后，唾液中特异性 sIgA水平较野生鼠显著降低（P＜0.05），对流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的鼻咽部清除作用受损。
　　结论:黏膜免疫 PD-ΔA146Ply融合蛋白能有效抵御流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的鼻咽部定植与致死性感染，是同时控制二者感染的良好疫苗候选物。其主要通过Th17应答影响黏膜表面特异性sIgA水平从而影响流感嗜血杆菌和肺炎链球菌在小鼠鼻咽部的定植。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1材料和方法

1.1主要试剂

1.2菌株及培养

1.3实验动物

1.4重组质粒构建及蛋白表达、纯化

1.5小鼠黏膜免疫及定植生存实验

1.6抗体水平检测

1.7细胞因子检测

1.8统计学分析

2结果

2.1 pd基因扩增及pET-28a(+)-pd-ΔA146Ply重组质粒的鉴定

2.2重组蛋白的分析鉴定

2.3细菌感染的保护效果

2.4免疫后小鼠血清和唾液中特异性抗体测定

2.5抗体亚型分析

2.6细胞因子分析

2.7 IL-17A在融合蛋白保护效果中的作用

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:黏膜佐剂研究进展

致谢

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