心外膜标记基因在小鼠和人胚胎心脏发育中的时空表达研究

摘要

本文对心外膜标记基因在小鼠和人胚胎心脏发育中的时空表达进行了研究。本研究分为三个部分：
　　第一部分：Tbx18-CRE及报告小鼠Rosa26EYFP、Rosa26LacZ小鼠的鉴定及Tbx18在小鼠胚胎心脏组织的示踪。
　　目的：有研究发现，Tbx18原本就在心肌细胞中表达，故质疑Tbx18是心外膜细胞的标记物。为了解决这一争议，我们繁殖、筛选、鉴定出Tbx18-CRE及Rosa26EYFP、Rosa26LacZ报告小鼠，建立Tbx18心外膜祖细胞遗传谱系示踪模型，来动态观察Tbx18在小鼠胚胎心脏发育过程中的时空定位表达。
　　方法：将 Tbx18-CRE knock in杂合子雄性小鼠与同背景的C57BL/6雌性小鼠交配，应用“一管酒精基因组抽提”法抽提基因组DNA，采用PCR鉴定出子代杂合Tbx18-CRE Knock in小鼠。应用免疫荧光双标法检测 Tbx18-CRE/Rosa26EYFP模型心外膜祖细胞标记基因的性质。
　　结果：⑴Tbx18-CRE、Rosa26EYFP、Rosa26 LacZ小鼠鉴定结果提示双杂合小鼠为具有CRE基因和报告基因（LacZ或EYFP）的小鼠，即为 Tbx18阳性心外膜祖细胞遗传谱系示踪模型，其通过检测报告基因，可以反应Tbx18本身的表达模式。⑵报告基因LacZ在10.5天胚胎前体心外膜及心外膜表达；在11.5天LacZ在胚胎心外膜表达，前体心外膜消失；⑶心脏切片 LacZ染色提示报告基因 LacZ在11.5天胚胎心外膜表达；⑷胚胎心脏切片免疫荧光染色提示报告基因YFP在11.5天胚胎心外膜表达；报告基因YFP在13.5天胚胎心外膜及心外膜下心肌表达，而 Tbx18仅在心房心外膜表达，心房心肌无表达。
　　结论：Tbx18是定位于小鼠早期胚胎心脏的心外膜，是心外膜的标志之一，Tbx18阳性EPCDs可分化形成心肌组织。
　　第二部分：人胚胎心脏心外膜标记基因Tbx18、Wt1、Tcf21的时空定位表达研究。
　　目的：心外膜祖细胞是近年来心肌再生研究的热点，既往仅在动物模型上进行胚胎心脏发育过程中心外膜标记基因的时空定位表达研究，且Tbx18、Wt1、Tcf21是否为心外膜重要的标记基因，在动物模型上仍存在质疑；Tbx18、Wt1、Tcf21在人胚胎心脏发育过程中的时空定位表达未见报道。因此，我们收集了不同发育阶段的人胚胎心脏组织，首次原位观察Tbx18、Wt1、Tcf21在人胚胎心脏发育过程中的时空定位表达。
　　方法：收集不同发育阶段的人胚胎心脏，冰冻切片后，取不同区域的组织进行免疫荧光染色和 DAPI染核，用抗转录因子 Tbx18抗体、抗转录因子Wt1抗体及抗转录因子Tcf21抗体分别对7w至12w人胚心脏连续冰冻切片进行免疫荧光染色，原位观察不同周龄的人胚胎心脏组织中Tbx18、Wt1、Tcf21表达的时空定位特异性。
　　结果：人胚胎心脏冰冻切片免疫荧光染色结果显示：（1）从7w至12w，Tbx18表达于人胚胎心脏的心外膜；从10w起，Tbx18表达于左心室心外膜及心外膜下的心脏组织中，室间隔处仍仅表达于心外膜；11w、12w在左室壁心脏组织中可持续地观察到大量的 Tbx18阳性细胞，室间隔处并未明显增多。在心房，Tbx18仅表达于心外膜。（2）从7w至12w，Wt1表达于人胚胎心脏的心外膜。从11w起， Wt1除了表达于心外膜以外，开始表达于左室壁和室间隔心外膜下的心脏组织中。12w人胚胎左室壁心外膜及心外膜下心脏组织中，可持续地观察到大量的Wt1阳性细胞。在心房，从11w起Wt1在心房组织的部分细胞开始表达，至12w，Wt1在心房组织中表达逐渐增多。（3）Tcf21在人胚胎左心室心外膜表达；从10w起，Tcf21表达于左室心外膜细胞及心外膜下的心脏组织中；11w、12w在左室心脏组织中Tcf21表达逐渐增多。在心房，早期胚胎心房心外膜无Tcf21表达；随着胚胎的发育，从9w至12 w，心房心外膜上Tcf21表达逐渐增多。
　　结论：在人胚胎心脏发育过程早期Tbx18、Wt1、Tcf21均表达于心外膜，是心外膜的重要标志物，只是三者在心外膜表达的部位及多少不同，并且三者迁移进入心脏组织的时间也略有不同。对于Tbx18作为心外膜关键标志物的研究结果与之前小鼠实验结果一致。
　　第三部分：人胚胎心脏组织中心外膜标记基因时空特性研究。
　　目的：本课题首次原位观察心脏组织中心肌标记基因Nkx2.5在人胚胎心脏发育过程中的时空定位表达及心外膜标记基因Tbx18、Wt1及Tcf21在人胚胎心脏心肌细胞本身是否表达。进一步明确Tbx18阳性、Wt1阳性及Tcf21阳性EPDCs的性质。
　　方法：收集7w至12w人胚心脏，进行冰冻切片后，取不同区域的组织，进行免疫荧光染色和 DAPI染核，检测 Tbx18、Wt1、Tcf21及Nkx2.5的表达。
　　结果：⑴人胚胎心脏冰冻切片免疫荧光染色显示：从7w至12w人胚胎心室心肌细胞中均有Nkx2.5阳性表达；而在心房是从7w至10w的心肌细胞中有Nkx2.5阳性表达，11w、12w心房心肌细胞几乎无Nkx2.5阳性表达。随着人胚胎周龄的增加，无论是心室或心房的心肌细胞Nkx2.5表达均逐渐减少。在各别周龄人胚胎心室、心房的心外膜处发现极少量Nkx2.5阳性表达细胞，这部分细胞的性质我们在本课题中无法明确，需要应用多种别的心肌细胞标记物或其他方法进一步明确。⑵免疫荧光双标染色结果为：9w人胚胎左心室、室间隔及心房心外膜上和10w、11w左心室及心房心外膜上Tbx18阳性细胞完全不与Nkx2.5共表达，提示这些细胞为Tbx18阳性心外膜祖细胞性质；11w时左心室、室间隔心脏组织中Tbx18阳性表达细胞逐渐增多，这些Tbx18阳性表达的细胞绝大多数不与Nkx2.5共表达；但在10w、11w室间隔心外膜处、11w左心室、室间隔心脏组织中可发现极少量共表达Tbx18和Nkx2.5的细胞；10w、11w、12w人胚胎心脏左心室、室间隔及心房的心外膜处可见Wt1阳性表达细胞，这些细胞几乎不共表达Nkx2.5，提示这些细胞为Wt1阳性心外膜祖细胞性质；从11w起，Wt1阳性表达的细胞开始从心脏左心室、室间隔及心房心脏组织中检测到，12w时在这些部位的心肌组织中可见较多的Wt1阳性表达细胞，而这些表达Wt1的阳性细胞几乎不与Nkx2.5共表达；9w、10w、11w人胚胎左心室、室间隔及心房心外膜处可见Tcf21阳性表达的细胞，这些细胞几乎不共表达Nkx2.5，故提示其为Tcf21阳性心外膜祖细胞性质；从10w起，表达Tcf21阳性细胞开始从心脏左心室、室间隔、心房心脏组织中检测到，11w时这些部位的Tcf21阳性表达细胞增多；这些表达Tcf21阳性的细胞约95％不共表达Nkx2.5；其中极少数共表达Tcf21和Nkx2.5的细胞性质需进一步实验明确。
　　结论：在人胚胎7w至12w心脏发育过程中，随着人胚胎周龄的增加，心脏组织中Nkx2.5表达逐渐减少。Tbx18、Wt1及Tcf21均为人胚胎心脏心外膜的标志基因，通过实验我们可以推论：在人心外膜标志基因中，Wt1可能是较其他两个更优的标记基因。

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第一部分：Tbx18-CRE及报告小鼠Rosa26EYFP、Rosa26LacZ小鼠的鉴定及Tbx18在小鼠胚胎心脏组织的示踪

前言

1 材料和方法

2 结果

3讨论

4 小结

参考文献

附图

第二部分：人胚胎心脏心外膜标记基因Tbx18、Wt1、Tcf21的时空定位表达研究

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

附图

第三部分：人胚胎心脏组织中心外膜标记基因时空特性研究

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

附图

文献综述:心外膜祖细胞在心脏发育及心肌细胞再生中的作用

致谢

攻读博士学位期间已发表及待发表的学术论文