信号素3A对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

摘要

目的：⑴研究信号素3A（Semaphorin3A，Sema3A）对SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)增殖和成骨分化的影响；⑵探讨ERK信号通路在Sema3A对SD大鼠BMSCs成骨向分化影响中的作用。
　　方法：①使用重组Sema3A因子（0.5ug/ml和1ug/ml）处理细胞，采用MTT法检测Sema3A对BMSCs增殖的影响；3d后，采用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法检测BMSCs成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP),骨钙素（OCN）及Runx2mRNA表达的变化；7d后采用酶比活性法检测细胞ALP活性；14d后用茜素红染色法检测Sema3A对BMSCs形成矿化结节的影响。②使用重组Sema3A因子处理细胞3d后，Western Blot法检测ERK1/2以及p-ERK1/2蛋白水平的变化。加入ERK1/2信号通路特异性抑制剂 PD98059后再用Sema3A处理细胞，作用3d后用Western Blot法检测ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平以及qRT-PCR法检测成骨相关基因的变化；处理细胞7d后，茜素红染色法检测矿化结节的形成。
　　结果：⑴使用重组Sema3A因子处理BMSCs后，MTT结果显示Sema3A因子对BMSCs的增殖无明显影响；qRT-PCR检测结果显示在两个浓度的Sema3A处理组BMSCs成骨相关的基因ALP,OCN和Runx2mRNA的表达量均比对照组低（P＜0.05）；细胞碱性磷酸酶活性在Sema3A处理组比对照组降低（P＜0.05）；茜素红染色结果显示BMSCs经Sema3A处理后矿化结节形成的量明显减少。⑵Western Blot结果显示ERK1/2蛋白磷酸化水平在成骨诱导组降低，而Sema3A处理细胞后可以使其水平升高。用ERK1/2信号通路特异性抑制剂 PD98059处理细胞后， ERK1/2蛋白磷酸化水平明显降低。Sema3A显著抑制ALP,OCN及Runx2mRNA的水平和矿化结节形成的量，但ERK信号通路被PD98059阻断后，Sema3A的作用则明显被减弱。
　　结论：Sema3A对BMSCs的增殖无明显影响，但抑制其成骨分化。这种抑制作用可能是Sema3A激活了ERK信号通路，使ERK1/2蛋白磷酸化水平升高而发挥作用。

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前言

第一部分 信号素3A对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化影响的实验研究

1材料与方法

1.1实验材料与仪器：

1.2实验方法

2结果

2.1大鼠BMSCs的鉴定

2.2 Sema3A对大鼠BMSCs增殖和成骨分化的影响

3讨论与结论

第二部分 信号素3A影响骨髓间充质干细胞成骨向分化的机制的初步研究

1材料与方法

1.1实验材料与仪器：

1.2实验方法

2结果

2.1 Sema3A对ERK1/2分子磷酸化的影响

2.2 ERK信号通路抑制剂PD98059对ERK1/2分子磷酸化的影响

2.3 ERK信号通路抑制剂PD98059对Sema3A抑制BMSCs成骨分化的影响

3讨论与结论

全文总结

参考文献

文献综述: 信号素3A对骨改建影响的研究进展

致谢

攻读硕士研究生期间参与发表的文章