IL-37通过IL-6/STAT3信号通路抑制HCC细胞侵袭和转移的机制研究

摘要

目的：以抗炎性细胞因子IL-37作为研究对象，观察其对HCC细胞侵袭和转移的影响及其可能的分子机制。
　　方法：收集54例肝癌新鲜组织标本，经qPCR和IHC检测癌组织及其对应癌旁组织中IL-37的表达水平，并用spearman秩相关分析、Kaplan-Meier生存曲线分析IL-37表达与肝癌临床病理特征、预后的相关性；qPCR和Western blot检测正常肝细胞系LO2，QSG-7701与肝癌细胞系SMMC-7721，HepG2的IL-37表达水平；构建过表达IL-37的慢病毒载体，并通过DNA测序鉴定其序列正确性；药筛法检测病毒滴度；将慢病毒感染SMMC-7721，HepG2细胞，获得过表达IL-37的稳定细胞株，观察感染后72 h细胞荧光分布，再通过Western blot检测IL-37表达水平；在HCC细胞中过表达IL-37和siRNA沉默IL-37，观察IL-37在体外对HCC细胞侵袭和转移能力的影响；Western blot检测SMMC-7721LV_NC和 SMMC-7721LV_IL1F7中 IL-6对 STAT3， pSTAT3（Y705）的激活情况；Western blot检测IL-6预处理SMMC-7721LV_NC、SMMC-7721LV_IL1F7、HepG2LV_NC、HepG2LV_IL1F7对E-cadherin，MMP2、Vimentin表达的影响；构建裸鼠肺转移瘤模型，观察SMMC-7721LV_NC与SMMC-7721LV_IL1F7肿瘤肺转移瘤数量的差异。
　　结果：在54对HCC组织中有37对（68.52％） IL-37的表达水平低于对应癌旁组织；IHC分析示：IL-37在癌组织中较癌旁组织呈低表达，并且有血管侵袭的肿瘤组织中IL-37表达水平更低；qPCR结果表明：在伴有门静脉侵犯的HCC组织中，IL-37的表达水平显著低于无静脉侵犯HCC组织和正常肝组织；IL-37在SMMC-7721、HepG2、QSG-7701、LO2细胞中的mRNA相对表达水平分别为0.167，0.433，1.143，1.043；IL-37的蛋白表达水平也证实了同样趋势；根据IHC的结果，以中位数作为分割线将54例HCC患者分为IL-37低表达组（n=27）和IL-37高表达组（n=27），IL-37的表达水平与HCC患者的血管侵袭（P=0.013）相关；用Kaplan-Meier法统计出IL-37的高、低表达患者的OS和DFS生存时间，两组患者生存时间的差异通过Log-rank检验分析，结果显示：IL-37的高表达组HCC患者的OS生存时间要显著长于低表达组（中位生存时间40.0 vs27.0月，P=0.040），此外，IL-37的高表达组HCC患者的DFS生存时间也要显著长于低表达组（中位生存时间27.0 vs17.0月，P=0.006）；将IL-37基因片段行PCR扩增后连接至线性化表达载体，阳性转换子PCR产物大小为849 bp，阴性转换子PCR产物大小为185 bp，测序结果显示：阳性克隆与目的基因序列完全一致；将GV358-IL1F7重组质粒转染293T细胞后，细胞内可观察到明显的绿色荧光，经Western blot检测可观察到30 kDa附近有特征条带，其分子量大小与目的基因相吻合；包装慢病毒48小时后提取并浓缩慢病毒，药筛法测得病毒滴度为9E+5 TU/ml；构建稳定过表达IL-37的SMMC-7721、HepG2细胞系及其对照组细胞系，观察感染后72 h细胞荧光分布，各组细胞的绿色荧光分布达90%以上，且无大面积细胞死亡发生，Western blot检测IL-37表达水平，IL-37的表达明显上调；划痕愈合实验结果显示：在过表达IL-37的HepG2细胞的体外迁移力明显低于对照组，24小时的愈合率分别为10±2%和64±3%（P＜0.001），在SMMC-7721细胞中，我们同样检测到过表达IL-37组的迁移能力显著低于对照组，24小时的愈合率分别为17.33%±2和55±3%（P＜0.001）；Transwell实验结果显示：过表达IL-37的HepG2细胞体外侵袭能力明显低于对照组，24小时穿过基质胶和微孔的细胞数量显著低于对照组（29±9 vs.62±8，P=0.002)，在过表达IL-37的SMCC-7721中，我们发现过表达IL-37的SMCC-7721细胞体外侵袭能力明显低于对照组，24小时穿过基质胶和微孔的细胞数量显著低于对照组（35±6 vs.86±11，P=0.01）；通过siRNA沉默HCC细胞中的IL-37的表达，在SMMC-7721、HepG2细胞中转染si_IL1F7及其对照si_NC，si_IL1F7组的IL-37的表达水平较si_NC组显著降低；用划痕愈合实验结果显示：在HepG2细胞中沉默IL-37组的迁移能力显著高于对照组，24小时的愈合率分别为90±3%和60±7%（P＜0.001），在SMMC-7721细胞中，沉默IL-37组的迁移能力显著高于对照组，24小时的愈合率分别为83.33%±3.6和53±2%（P＜0.001）；Transwell实验结果显示沉默IL-37的HepG2细胞体外侵袭能力明显高于对照组，24小时穿过基质胶和微孔的细胞数量显著低于对照组（102±12 vs.39±9，P=0.002），在沉默IL-37的SMCC-7721中，沉默IL-37的SMCC-7721细胞体外侵袭能力明显低于对照组，24小时穿过基质胶和微孔的细胞数量显著低于对照组（94±18 vs.49±4，P=0.002）；用重组人 IL-6处理 SMMC-7721LV_NC和 SMMC-7721LV_IL1F7细胞， SMMC-7721LV_IL1F7细胞可显著抑制 IL-6对 STAT3的激活作用；SMMC-7721LV_IL1F7细胞与SMMC-7721NC细胞相比，E-cadherin显著上调，MMP9、Vimentin表达显著下调，且IL-37可逆转IL-6引起的蛋白表达变化；裸鼠肺转移瘤实验结果示：SMMC-7721LV_IL1F7组较SMMC-7721LV_NC组肺转移灶数量显著减少，两组之间有显著性差异（3.400±1.435 vs.14.00±1.817， P＜0.001，n=5）。
　　结论：通过本课题的研究证实IL-37具有抑制肝细胞癌侵袭转移的能力，其分子机制可能与抑制IL-6/STAT3信号通路诱导的EMT有关。IL-37在HCC进展中的分子机制可能有助于临床HCC或其他癌症治疗策略的制定，提供新的思路和治疗靶点。