新型肺靶向多西他赛脂质体的研究及毒性评价

摘要

肺癌已成为恶性肿瘤发病和死亡的首要原因，其中以NSCLC发病率和和死亡率最高。化疗是重要的治疗手段，且能防止肿瘤的转移与复发。临床上，治疗NSCLC主要的化疗药物如紫杉醇和多西他赛等，虽然作用较好，但由于体内的广泛分布而存在用药量大、毒副作用大等问题，限制了使用。因此，开发高效低毒的抗癌药物，寻找针对NSCLC的化疗药物及其制剂的研究已成为当前医药学领域亟待攻克的难关。为此，本课题组采用DBaumNC专利新技术制备了新型多西他赛脂质体(Docetaxel liposome，DTX-LP)，作为一个新型的肺靶向制剂，改变了DTX在体内的分布行为，这样一来DTX将会对靶器官和各组织有什么影响或者什么结果，以及是否将产生新的毒性反应，亟需去研究和考察。 本文拟在DTX-LP肺靶向下，以多西他赛注射液(Docetaxel injection，DTX-IN)作为参比制剂，考察新型DTX-LP对肺等主要组织器官的毒性影响，阐明毒性反应发生、发展的规律，探讨肺靶向DTX-LP安全性和疗效的生物学评价。 首先，DTX-LP的制备及质量评价研究。采用DBaumNC专利新技术制备了具有特定亚微米级尺寸和体外具缓释行为的DTX-LP，以固体形式保存，具有良好的物理和化学稳定性，通过DSC和XRD分析方法表征，于2～8℃避光密封放置12月，无原料结晶析出。药物含量为6.66±0.18mg/g；水化后DTX-LP的粒径0.72±0.23μm，电位-27.5mV，包封率为90.47±1.65%，热原检查、特殊安全检查（溶血性和刺激性）均符合静脉注射用要求，为进一步体内毒性研究奠定了基础。 其次，DTX-LP的肺靶向作用研究。基于红细胞作为载体的理论，探讨了DTX-LP在兔体内的肺靶向作用机制，即可能为粘附于红细胞表面的DTX-LP随血液循环送达肺组织，当红细胞被挤压通过比自身直径更小的肺毛细血管，使DTX-LP脱落而粘附于肺上皮细胞，而实现肺部聚集。采用核素标记放射显影和组织器官浓度法进一步确证了DTX-LP的肺靶向作用。SPECT/CT评价可视化地观测了DTX-LP在肺部的聚集。采用组织器官浓度法的定量研究结果显示，DTX-LP组在肺组织的AUC0-t是DTX-IN组的16倍；而心和肾组织分别降低至0.51倍和0.55倍，在肝和脾组织分别为1.11和1.04倍。这表明DTX-LP具有较高的肺靶向效率，在其他组织中无显著蓄积作用。 第三，DTX-LP的体外细胞毒性实验。采用A549肺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞两种细胞评价了空白脂质体、载药脂质体的体外细胞毒性，其结果表明，空白脂质体无明显的细胞毒性作用；DTX-LP的细胞毒性在一定浓度范围具有剂量依赖性，并且DTX-LP的体外细胞毒性作用显著强于DTX-IN，这表明DTX-LP可增强DTX的体外细胞毒性作用。 第四，DTX-LP的急性毒性研究。以急性毒性方法评价了DTX-LP在小鼠和兔体内的安全性。采用最大给药量法（Maximal feasible dose，MFD）显示，DTX-LP在小鼠的最大给药量为9.9mg/kg，该剂量下无动物死亡，毒副反应包括活动减少（困倦、俯卧），体重减轻，胃肠道反应（食欲下降、腹泻）；系统解剖结果表明，肺有明显组织水肿，脏器系数无显著性差异。DTX-LP在兔体内出现的毒副作用与小鼠相似；血液毒性呈剂量依赖性。在两种实验动物（小鼠和兔）体内急性毒性研究结果表明，毒性靶器官包括肺组织，胃肠道和血液系统。除了拟定的药效学靶器官（肺），DTX-LP并没有产生更严重的毒性作用。 第五，DTX-LP的毒性研究。采用随机设计和对照方法，进一步研究DTX-LP对兔的毒性，同时进行毒代动力学研究。其实验结果表明，DTX-LP血浆中的暴露（AUC）与剂量呈线性相关；DTX-LP降低了DTX的血浆AUC和Cmax；多次累积给药后不会改变DTX-LP在兔血浆中的动力学特征。与此同时，采用UPLC-MS/MS方法的体内代谢研究显示，除能检测DTX和已知代谢产物M-2外，在DTX-LP组和DTX-IN组的胆汁和粪便中发现三种新的未知代谢产物Mun-1（相对分子质量821）、Mun-2（相对分子质量837）和Mun-3（相对分子质量819）。根据建立的兔毒性评价分级标准，DTX-LP能够降低同等剂量下DTX-IN严重血液毒性（Ⅲ和Ⅳ级）的发生率以及对心和肾的损害作用，并且对血液、肝和脾的毒性能够恢复；在相同的累积剂量下，不同给药周期（三周一次和每周一次）的比较研究显示，DTX-LP以低剂量多次给药方式可降低骨髓抑制作用。 综上所述，本课题组研制的DTX-LP，具有良好物理化学稳定性和生物相容性，以脂质体载体方式将DTX主要靶向送至肺部，而降低了其他组织如血液、心和肾等的分布，显著改善了目前临床应用DTX-IN的全身性系统毒性，为新型制剂DTX-LP全面、系统的安全性评价奠定了较好的基础。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 DTX-LP的制备及质量评价研究

1 材料与仪器

2 方法与结果

3 讨论

4 小结

第二部分 DTX-LP的肺靶向作用研究

1 材料与仪器

2 方法与结果

3 讨论

4 小结

第三部分 DTX-LP的体外细胞毒性实验

1 材料与仪器

2 方法与结果

3 讨论

4 小结

第四部分 DTX-LP的急性毒性研究

1 材料与仪器

2 方法与结果

3 讨论

4 小结

第五部分 DTX-LP的毒性研究

1 材料与仪器

2 方法与结果

3 讨论

4 小结

全文总结

1. DTX-LP的制备及质量评价研究

2. DTX-LP的肺靶向作用研究

3. DTX-LP的体外细胞毒性实验

4. DTX-LP的急性毒性研究

5. DTX-LP的毒性研究

本文的创新点

参考文献

附图

附表

文献综述:紫杉烷类抗肿瘤药物毒理学研究概述

致谢

在读期间发表的研究论文