Curcumin增强阿尔茨海默病自噬体的轴突转运

摘要

目的：阿尔茨海默病（AD）是一种中枢神经系统的进行性退行性变性疾病。轴突转运障碍所致的自噬体大量堆积于轴突并影响Aβ的代谢，促进AD发生发展，且分子马达 dynein和微管相关蛋白2（MAP2）与自噬体轴突转运障碍和AD发展密切相关；而 GSK-3β参与调控 dynein，是 AD治疗新靶点。姜黄素（Curcumin）是姜科草本植物姜黄根茎提取的植物化合物，可显著抑制Aβ产生，在AD中发挥神经保护作用，但其机制尚未完全阐明。本研究拟通过体内和体外实验，首先观察 Curcumin对自噬现象和自噬体轴突转运的影响,再探讨自噬体轴突转运相关的分子马达dynein和微管相关蛋白MAP2的表达以及Aβ产生的作用，并进一步分析该作用是否与GSK-3β有关。本研究从一个全新的视角探讨Curcumin多重脑保护作用的分子机制，为Curcumin预防和治疗AD提供新的实验依据。
　　方法：体内实验：将6个月龄大小的APP/PS1双转基因Tg2576小鼠随机分为3组：普通饲喂组（按照正常普通饲料喂养）、低浓度组（喂养含 Curcumin0.16g/Kg混合饲料）、高浓度组（喂养含Curcumin1.0g/Kg混合饲料）。每组10只，连续喂养6月。采用Morris水迷宫检测Curcumin对双转基因鼠空间学习记忆能力的影响；免疫组化检测双转基因小鼠Aβ42的沉积；透射电镜观察小鼠脑内自噬体的形态变化；Western blot检测小鼠脑内Beclin1、LC-3的表达；免疫组化检测微管相关蛋白2（Microtuble-associate Proteins2，MAP2）的表达变化；Western blot检测Tau、p-Tau（Ser404）、糖原合成酶激酶-3β（Glycogen Synthase Kinase-3β，GSK-3β）、p-GSK-3β（Tyr216）、动力蛋白中间链（Dynein intermediate chain，DIC）蛋白表达变化。体外实验：将 N2a/WT和 N2a/APP695swe分为以下4组：WT组（N2a/WT细胞）、对照组（5μM DMSO处理N2a/APP695swe24h）、低浓度组（1.25μM Curcumin处理 N2a/APP695swe24h）、高浓度组（5μM Curcumin处理N2a/APP695swe24h）。ELISA检测Aβ42的表达变化；电镜观察N2a/APP695swe细胞内自噬体的形态变化；Western blot检测N2a/APP695swe细胞Beclin1、LC-3的表达；免疫荧光检测LC3与Aβ的共定位；Western blot检测N2a/APP695swe细胞内Tau、p-Tau（404）、GSK-3β、p-GSK-3β（Tyr216）和DIC蛋白表达变化；mRFP-GFP-LC3腺病毒转染观察细胞自噬体与溶酶体结合情况。
　　结果：体内实验：Curcumin明显改善转基因鼠的学习记忆能力；免疫组化显示经Curcumin处理后小鼠脑内Aβ42明显减少；电镜发现经Curcumin处理后小鼠脑内轴突堆积的自噬体减少、胞体中自噬溶酶体增多；Western blot结果显示Curcumin增加Beclin1、LC-3II/I的表达；免疫组化显示经Curcumin处理后小鼠脑内MAP2明显增加（p＜0.05）；Western blot结果显示Curcumin抑制p-Tau（Ser404）/Tau、p-GSK-3β（Tyr216）/GSK-3β表达，增加DIC的表达。体外实验：ELISA结果显示N2a/APP695swe细胞经Curcumin处理后Aβ42减少（p＜0.05）；电镜发现经 Curcumin处理后自噬体和自噬溶酶体均增多；Western blot结果显示Curcumin增加Beclin1、LC-3II/I的表达，抑制p-Tau（Ser404）/Tau、p-GSK-3β（Tyr216）/GSK-3β表达，增加的DIC表达；LC3与Aβ存在共定位；自噬体与溶酶体结合增加。
　　结论：Curcumin可以增强 AD中自噬体的轴突转运，表现为轴突中堆积的自噬体减少，胞体中自噬溶酶体增多，自噬的轴突转运相关的主要分子马达DIC上调， MAP2表达增加，并抑制Tau蛋白过度磷酸化。Curcumin增强AD中自噬体轴突转运的作用与其抑制GSK-3β的活性有关。

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前言

1材料与仪器

1.1 材料

1.2 主要的仪器设备

2实验方法

2.1细胞分组

2.2细胞培养

2.3 透射电镜观察细胞自噬体

2.4 免疫荧光

2.5动物分组及处理

2.6免疫组化实验

2.7蛋白印迹实验

2.8 ELISA实验

2.9统计学分析

3结果

3.1 Curcumin明显改善APP/PS1双转基因鼠的学习记忆能力

3.2 Curcumin减少APP/PS1双转基因鼠大脑中Aβ42的沉积

3.3 Curcumin减少N2aAPP695swe细胞Aβ42的产生

3.4 Curcumin增加APP/PS1双转基因鼠大脑中神经元胞浆中自噬溶酶体

3.5 Curcumin增加N2aAPP695swe细胞中自噬溶酶体的数量

3.6 Curcumin增强APP/PS1双转基因小鼠脑内Beclin1、LC3-II/I的表达

3.7 Curcumin增强N2aAPP695swe细胞内Beclin1、LC3-II/I的表达

3.8 Curcumin降低N2aAPP695swe细胞凋亡率

3.9 Curcumin对APP/PS1双转基因小鼠脑内MAP2、Tau以及p-Tau （Ser404）的影响

3.10 Curcumin对APP/PS1双转基因小鼠脑内DIC、GSK-3β和p-GSK-3β（Tyr216）表达的影响

3.11 Curcumin对N2aAPP695swe细胞内DIC、GSK-3β、p-GSK-3β（Tyr216）的表达的影响

3.12 GSK-3β激活剂Wortamanin对N2Aapp695swe细胞内DIC、GSK-3β和p-GSK-3β（Tyr216）的表达的影响

4讨论

4.1 Curcumin改善AD转基因鼠的学习记忆能力

4.2 Curcumin减少AD转基因鼠和细胞模型中Aβ的沉积

4.3 Curcumin对AD中自噬现象的影响

4.4 Curcumin促进自噬体的突触转运依赖于GSK-3β的活性

参考文献

文献综述: 自噬体轴突转运在AD中的作用

致谢

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