MPPa-PDT诱导的人骨肉瘤MG-63细胞凋亡和自噬

摘要

目的：
　　Pyropheophorbide-αmethyl ester(MPPa)属于第二代光敏剂，具有很好的应用前景。本研究以体外培养的人骨肉瘤MG-63细胞为研究对象,采用MPPa介导的光动力疗法（MPPa-PDT）处理人骨肉瘤MG-63细胞，检测MPPa-PDT能否诱导MG-63细胞发生凋亡和自噬反应并在信号通路转导和蛋白表达水平探索其可能的分子机制，最后进一步探索MPPa-PDT作用下MG-63细胞自噬与凋亡的关系。为MPPa-PDT用于骨肉瘤的临床治疗以及调节自噬和凋亡水平以增强 MPPa-PDT的抗肿瘤效应奠定实验理论基础。
　　方法：
　　MPPa-PDT作用于体外培养的人骨肉瘤MG63细胞，采用CCK-8检测细胞活性的变化，以明确 MPPa-PDT对 MG-63细胞的毒性效应,并选择后续实验所采用的MPPa药物剂量和LED光照能量密度。然后应用Hoechst荧光染色观察细胞凋亡，Annexin V-PI染色后应用流式细胞术检测MG-63细胞凋亡水平的变化，应用Western blot检测MG-63细胞内凋亡相关蛋白表达水平的变化，探明 MPPa-PDT能否诱导MG-63细胞发生凋亡。应用JC-1染色荧光显微镜和流式细胞术检测细胞线粒体膜电位(MtΔψ)的变化，应用Western blot检测线粒体凋亡通路相关蛋白表达水平的变化，明确线粒体凋亡途径是否参与 MPPa-PDT诱导的MG-63细胞凋亡。应用MDC染色观察细胞的自噬小体，应用透射电镜观察细胞的超微结构，进一步采用Western blot检测自噬标志性蛋白表达水平的变化，明确MPPa-PDT能否诱导MG-63细胞发生自噬。应用 DCFH-DA染色荧光显微镜和流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平，Western blot检测Jnk磷酸化水平的变化，明确MPPa-PDT能否激活MG-63细胞内的ROS-Jnk通路；采用ROS清除剂（NAC）和Jnk抑制剂（SP600125）分别清除细胞内ROS和抑制Jnk的激活，通过Western blot检测Jnk的磷酸化水平、自噬标志性蛋白的表达水平，明确ROS-Jnk通路是否参与MPPa-PDT诱导的MG-63细胞自噬。最后采用自噬抑制剂（3-MA和CQ）抑制细胞自噬水平，Annexin V-PI染色后采用流式细胞术检测细胞凋亡水平的变化，采用Western blot检测凋亡相关指标表达水平的变化，明确MPPa-PDT作用下MG-63细胞自噬与凋亡的关系。
　　结果：
　　MPPa-PDT能明显抑制人骨肉瘤 MG63细胞的活性，且其抑制作用呈MPPa浓度-光照能量密度剂量依赖性。MPPa-PDT能诱导细胞凋亡，并伴随有线粒体凋亡途径的激活，主要表现为 MPPa-PDT处理后细胞凋亡率明显升高，凋亡相关蛋白表达水平升高，同时线粒体膜电位降低，线粒体凋亡相关蛋白表达升高。MPPa-PDT能诱导细胞自噬，并且ROS-JNK通路参与了MPPa-PDT诱导的MG-63细胞自噬，表现为MPPa-PDT处理后细胞MDC染色荧光明显增强，MDC阳性的斑点样结构明显增多，电镜可观察到典型的自噬小体结构，自噬标志性蛋白表达水平明显升高；ROS清除剂（NAC）和Jnk抑制剂（SP600125）都能抑制MPPa-PDT所诱导的自噬，且ROS清除剂能抑制Jnk的磷酸化。MPPa-PDT诱导的自噬可促进MG-63细胞凋亡的发生，表现为自噬抑制剂(3-MA和 CQ)预处理可明显降低细胞的凋亡率和凋亡相关蛋白的表达水平。
　　结论：
　　线粒体途径参与MPPa-PDT诱导的MG-63细胞凋亡，ROS-Jnk信号通路参与MPPa-PDT诱导的MG-63细胞自噬；并且MPPa-PDT诱导的自噬促进MG-63细胞凋亡的发生。

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英汉缩略语名词对照

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前言

1 材料与方法

1.1细胞株

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4主要试剂的配制

1.5细胞培养

1.6实验分组及处理

1.7 MPPa-PDT处理MG-63细胞，CCK-8检测细胞活性

1.8 Hochest细胞核染色法观察细胞凋亡

1.9 MDC染色检测自噬泡

1.10 DCFH染色检测细胞ROS水平

1.11 JC-1染色检测细胞线粒体膜电位

1.12透射电镜观察细胞超微结构

1.13流式细胞术检测细胞凋亡率

1.14 Western blot分析

1.15统计学分析

2结果

2.1 MPPa-PDT对人骨肉瘤MG-63细胞活性的抑制作用

2.2 MPPa-PDT诱导MG-63细胞凋亡

2.3线粒体途径参与了MPPa-PDT诱导的MG-63细胞凋亡

2.4 MPPa-PDT诱导MG-63细胞自噬

2.5 ROS-Jnk信号通路参与了MPPa-PDT诱导的MG-63细胞自噬

2.6 MPPa-PDT诱导的骨肉瘤MG-63细胞自噬与凋亡的关系

3 讨论

4 结论

参考文献

附插图

文献综述: JNK信号通路调节自噬的研究进展

致谢

攻读硕士期间的科研情况简介