肿瘤相关巨噬细胞在索拉非尼抑制HCC中的作用及分子机制研究

摘要

第一部分肿瘤相关巨噬细胞的诱导与表型鉴定
　　目的：体外诱导人PBMC细胞生成M1和M2型巨噬细胞，并分析其生物学表型特征。
　　方法：本实验首先分离获得人外周血单核细胞（PBMC），再通过粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）或巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）分别刺激 PBMC细胞分化成为 M1型巨噬细胞或 M2型巨噬细胞；Real-time PCR检测不同巨噬细胞表面分子 CD68、HLA-DR、CD206及细胞因子TGF-β的mRNA表达水平；通过LPS分别刺激M1和M2型巨噬细胞，ELISA检测不同巨噬细胞分泌IL-10、IL-12及CD206的蛋白表达水平。
　　结果：经GM-CSF诱导生成的M1型巨噬细胞CD68和HLA-DR表达量明显增加，ELISA结果显示其IL-12表达显著增高；而经M-CSF诱导生成的M2型巨噬细胞CD206表达量明显增加，ELISA结果表明其IL-10蛋白表达显著增高，IL-12蛋白表达显著降低。
　　结论：体外成功诱导建立了M1型和M2型巨噬细胞，生物学表型符合各自特征。
　　第二部分肿瘤相关巨噬细胞对HCC细胞生长及转移的作用及机制研究
　　目的：探讨肿瘤相关巨噬细胞对HCC细胞生长及转移的作用，并分析其分子机制。
　　方法：首先通过 CCK-8法分析比较单独培养以及与 M1/M2型巨噬细胞共培养后的 HepG2及 Huh-7细胞的生长情况；采用 Transwell实验检测单独培养以及与 M1/M2型巨噬细胞共培养后的 HepG2及Huh-7细胞的迁移侵袭能力；western blot检测 E-cardherin、Vimentin等EMT相关蛋白的表达；运用体外双荧光素酶报告基因检测miR-101与其靶基因DUSP1的结合情况；经LPS刺激的M2型巨噬细胞分别给予不同条件处理，Real-time PCR检测miR-101的mRNA表达，western blot检测DUSP1及其下游ERK、p38、JNK的蛋白表达情况。
　　结果：相较于单独培养组及与M1型巨噬细胞共培养组，M2型巨噬细胞可以明显增加 HepG2及 Huh-7细胞的增殖能力和迁移侵袭能力；western blot结果显示，与 M2型巨噬细胞共培养后的 HCC细胞E-cardherin表达降低，而 N-cardherin、Vimentin蛋白表达明显增加；双荧光素酶报告系统证实 miR-101可以通过直接与 DUSP1的3'-UTR区发生互补结合，从而抑制其 mRNA和蛋白的表达；经 AKT抑制剂处理后M2型巨噬细胞miR-101表达下调，导致DUSP1的蛋白表达上调，从而影响其下游ERK、p38、JNK的蛋白表达。
　　结论：M2型巨噬细胞可增加HCC细胞的生长及迁移侵袭能力，其机制可能与miR-101调控DUSP1的表达，进而影响其下游ERK、p38、JNK信号通路有关。
　　第三部分索拉非尼通过miR-101调控肿瘤相关巨噬细胞释放TGF-β抑制HCC生长的机制研究
　　目的：探讨肿瘤相关巨噬细胞在索拉非尼抑制HCC中的作用及其分子机制。
　　方法：为了检测索拉非尼对 M2型巨噬细胞中 miR-101表达的调控，我们将M2型巨噬细胞分别给予LPS和（或）索拉非尼处理，western blot检测DUSP1及其下游ERK、p38、JNK的蛋白表达情况，Real-time PCR检测TGF-β、CD206的mRNA表达水平，ELISA检测TGF-β、CD206的蛋白表达水平；通过 CCK-8法分析比较单独培养以及与M1/M2型巨噬细胞共培养的HepG2及 Huh-7细胞经索拉非尼干预前后的生长情况，采用 Transwell实验检测与 M2型巨噬细胞共培养的HepG2及 Huh-7细胞经索拉非尼干预前后的迁移侵袭能力，western blot检测 E-cardherin、Vimentin等 EMT相关蛋白的表达；检测 HCC细胞与经TGF-β阻断剂处理后的M2型巨噬细胞共培养的生长及转移情况；构建小鼠 HCC模型并给予索拉非尼处理，免疫组化方法检测TGF-β及巨噬细胞表面分子 CD68、HLA-DR、CD206的表达水平；Real-time PCR检测人HCC组织中TGF-β、CD206的mRNA表达水平，采用免疫组化检测人HCC组织中TGF-β及CD206表达水平，并分析其与临床病理资料的关系。
　　结果：western blot结果显示，索拉非尼能明显增加DUSP1的表达，而降低ERK、p38、JNK的蛋白表达；Real-time PCR结果显示，给予索拉非尼干预的M2型巨噬细胞miR-101、TGF-β、CD206的 mRNA表达下调；ELISA结果显示TGF-β、CD206的蛋白表达下调；索拉非尼可以抑制与M2型巨噬细胞共培养的HCC细胞的生长及迁移侵袭能力；western blot实验显示，共培养后的HCC细胞E-cardherin表达降低，而N-cardherin、Vimentin蛋白表达明显增高；与经TGF-β阻断剂处理后的M2型巨噬细胞共培养的HCC细胞的生长及转移明显降低；通过体内实验发现，索拉非尼能够明显抑制肿瘤的生长，并且抑制HCC组织中TGF-β、CD206的表达；免疫组化结果显示，人HCC组织中TGF-β及CD206表达增加，并与HCC发生关系密切。
　　结论：索拉非尼可以通过抑制M2型巨噬细胞中miR-101的表达，使其失去对靶基因DUSP1的调控，进而抑制ERK、p38、JNK信号通路，影响M2型巨噬细胞释放TGF-β发挥抑制HCC细胞增殖及侵袭转移的作用。

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参考文献

第一部分 肿瘤相关巨噬细胞的诱导与表型鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 肿瘤相关巨噬细胞对HCC细胞生长及转移的作用及机制研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 索拉非尼通过miR-101调控肿瘤相关巨噬细胞释放TGF-β抑制HCC生长的机制研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述:肿瘤相关巨噬细胞在HCC发生发展中的作用

致谢

攻读博士学位期间发表的论文