高强度聚焦超声辐照活体兔眼角膜后对视网膜及视神经的影响

摘要

目的：高强度聚焦超声（High Intensity Focused Ultrasound, HIFU）作为一种新兴的体外无创治疗技术已经广泛应用于妇产科、肝胆外科、泌尿外科等各个医学领域，尤其是临床实体肿瘤的治疗。20世纪80-90年代的临床实验中发现，高强度聚焦超声在眼科领域中可以用于治疗青光眼疾病，然而其运用于眼科治疗相关疾病是否具有安全性罕见报道。本课题组早期研究中已证实HIFU可以通过改变活体兔眼角膜的屈光状态以矫正老视，因而本研究探讨高强度聚焦超声辐照活体兔眼角膜后对视网膜和视神经的影响，为HIFU应用于活体角膜临床治疗的安全性提供理论支持。
　　方法：1.HIFU辐照活体兔眼角膜动物模型的构建：设置CZF型超声治疗仪治疗参数为功率1w、频率10.20MHz、脉冲1000Hz、焦距4.5mm、辐照时间6S（电动机以10r/min速度带动超声波治疗头匀速旋转1周所需时间）、辐照环直径约9mm、辐照方式以圆环状聚焦定位辐照活体兔眼角膜基质，制作角膜焦域环。选取7只健康成年且眼部无疾患新西兰大白兔，每只实验兔右眼标记为实验组，左眼标记为对照组。实验组用HIFU以圆环状定位辐照角膜基质，对照组未行任何处理作为正常空白对照。于术毕后1、7、14、30、60、90天行裂隙灯显微镜下观察拍照；随机选取5只于术前、术毕后1、7、14、30、60、90天行自动验光仪测量术眼角膜曲率。2.HIFU辐照活体兔眼角膜后对视网膜的组织形态学及生物学变化观察：41只健康新西兰大白兔中随机挑取36只（共72眼），将分别于术毕后1、7、14、30、60、90天随机抽取6只（12眼）处死后摘除眼球取材固定，光镜下观察视网膜细胞层数和各层细胞排列情况以及视神经组织形态变化；透射电镜下观察术后视神经细胞超微结构；并用免疫组化法检测视网膜中勿动蛋白（Nogo-A）的活性表达；原位末端标记法（TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL）检测视网膜各层细胞凋亡的情况；检测视网膜组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量。余5只作为OCT组，分别于术前、术后1、7、14、30、60、90天行光学相干断层扫描仪(Optical Coherence Tomography, OCT)扫描观察视网膜形态并测量视网膜厚度值。
　　结果：
　　1.成功构建HIFU辐照活体兔眼角膜动物模型。
　　2.裂隙灯观察结果：HIFU辐照活体兔眼角膜后即刻角膜辐照范围上皮出现部分缺损，基质层形成灰白色焦域环，与周边正常组织分界清楚，荧光素钠染色可见所对应部位着染，辐照焦域环于术后7天逐渐变淡直至消失，荧光素钠染色为阴性，未见着染，角膜恢复透明。
　　3.自动验光仪测量结果：HIFU辐照兔眼角膜术后1、7、14天角膜平均曲率较术前稍有增加，其中7天时增加最为显著。术后30、60、90天角膜曲率较术前有所降低，其中术后90天角膜曲率稍有增高但曲率值未大于术前角膜曲率。
　　4.光镜下视网膜HE染色结果：对照组视网膜各层排列规律整齐，无散乱排列，视网膜节细胞层核清楚分明，视网膜各层间界线清晰厚度正常，间隔较密。辐照后各个时间节点切片HE染色光镜下观察结果较辐照前无明显变化。
　　5.光镜下视神经HE染色结果：对照组视神经横切面神经纤维排列均匀规整，基质淡红染，无炎性细胞浸润，间隔均匀，血管形态完好。术后各时间点视神经组织切片HE染色光镜下结果较术前无明显改变。
　　6.电镜下视神经超微结构观察结果：对照组视神经纤维髓鞘完整、光滑致密，排列规整，无脱髓鞘改变。术后各时间点视神经超微结构较术前未见明显变化。
　　7.视网膜免疫组化结果：正常视网膜中可见神经节细胞层、内、外颗粒层有少量的Nogo-A阳性表达。术后各个时间点实验组在视网膜神经节细胞层、内核层和外核层均有Nogo-A表达，与正常对照组比较表达未见明显增强。
　　8.视网膜细胞凋亡检测结果：对照组及各实验组视网膜神经节细胞层（RGCS）未见阳性凋亡细胞，无细胞核皱缩或核碎裂、染色质凝集等征象。
　　9.视网膜组织中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量测定结果：术后1天及7天实验组与对照组比较，实验组SOD活力均低于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。不同时间点，实验组组间相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。经统计分析，实验组MDA含量均高于并接近于对照组MDA含量，同一时间点实验组与对照组相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。实验组在各个时间点的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　10.视网膜光学相干断层扫描结果：OCT组实验兔结果显示不同时间点实验组与正常对照组的视网膜结构均正常，视网膜内层结构清晰可见，各层结构界线分明、显像清晰。术前视网膜厚度均高于术后各时点视网膜厚度，但经统计分析后同一时间点实验组与对照组间的数据比较差异没有统计学意义（P＞0.05）且不同时间点组间的数据比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.适当剂量的HIFU可准确定位于角膜基质层，对辐照区外正常角膜组织无明显损伤；HIFU可利用其热机制作用于角膜使角膜基质胶原纤维收缩，角膜曲率增加，表明将HIFU应用于角膜改变其屈光状态的模式具有安全可行的特点。
　　2.HIFU辐照活兔眼角膜后对视网膜及视神经组织学形态及各生物活性因子无显著影响，因此HIFU在辐照眼角膜治疗角膜疾病及改变屈光状态的同时对视网膜及视神经是安全可靠的。提示HIFU在眼科屈光领域具有巨大应用前景。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1.老视矫正手术的现状

2.高强度聚焦超声矫正老视的新思路

第一部分 高强度聚焦超声辐照活体兔眼角膜动物模型的构建及角膜屈光状态的改变

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 裂隙灯显微镜观察结果

2.2 自动电脑验光仪检测角膜平均曲率结果

3讨论

第二部分 高强度聚焦超声辐照后视网膜和视神经组织形态学及生物学变化的研究

1材料与方法

1.1材料

1.2 方法

2结果

2.1光镜下视网膜HE染色结果

2.2光镜下视神经HE染色结果

2.3电镜下视神经超微结构观察结果

2.4视网膜免疫组化结果

2.5 视网膜凋亡细胞检测结果

2.6视网膜组织中SOD活力和MDA含量检测结果

2.7 视网膜光学相干断层扫描结果

3讨论

全文总结

参考文献

附图

文献综述:高强度聚焦超声技术在医学领域中的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章