预定位靶向卵巢癌超声分子成像与治疗实验研究

摘要

背景：
　　卵巢癌的发病率在女性生殖系统肿瘤中排名第三，其病死率高居第一。虽然卵巢癌患者的死亡与多种因素有关，但早期诊断、早期及正确的治疗不可否认是降低其死亡率的关键。因此，如何实现卵巢癌的早期诊断、选择适合不同患者的恰当的治疗方案，一直以来都是医务工作者们努力的方向。目前，靶向各种肿瘤的PLGA纳米粒的制备、载药、载基因等是超声分子显像与治疗的研究热点。将化疗药物紫杉醇包载入靶向卵巢癌的相变型 PLGA纳米粒中，不仅可以实现卵巢癌超声分子显像，实现卵巢癌的早期诊断，还能解决紫杉醇因疏水性而带来的给药受限的问题，提高药物效能、减少药物用量、降低药物毒副作用。传统的肿瘤靶向方式多为直接靶向法，虽操作简便，但容易受到体内微环境的影响，同时，常用的直接靶向法在配体在与 PLGA效应分子共价结合过程中，可能会因竞争性而抑制部分配体上的功能基团与受体结合，而导致靶向性减低。为此，如何提高靶向肿瘤效率成为学者们努力解决的难题。预定位技术源于放射性核素显像，该技术可有效提高肿瘤靶/非靶比值。然而鲜有将该技术运用到超声分子成像研究中。本研究拟制备携载广谱化疗药物紫杉醇的相变型 PLGA多功能纳米粒，并采用生物素-链霉亲和素二步法预定位技术，研究相变型PLGA多功能纳米粒联合预定位技术在卵巢癌细胞的体外寻靶、杀伤癌细胞中的效能，旨在探索预定位技术用于肿瘤靶向超声分子成像与治疗的可行性，为卵巢癌的精准诊疗提供新思路。
　　目的：
　　⑴制备链霉亲和素化的载紫杉醇相变型 PLGA纳米粒（PTX-PLGA-SA/PFPs），检测该纳米粒紫杉醇的包封率、观察其体外释药特征，及低功率聚焦超声（LIFU）致其相变后增强超声造影情况及光镜下热致相变情况。⑵探讨相变型载药 PLGA纳米联合预定位技术在卵巢癌细胞的体外寻靶、杀伤癌细胞中的效能，为进一步研究预定位技术提高体内肿瘤组织的靶向超声分子成像与治疗提供前期的研究基础。
　　方法：
　　①采用单乳化法（O/W）制备载紫杉醇相变型 PLGA纳米粒（PTX-PLGA/PFPs）并通过碳二亚胺法将其进行链霉亲和素化（PTX-PLGA-SA/PFPs）。通过高效液相色谱法（HPLC）检测紫杉醇的包封率及载药量，并通过恒温摇床透析法研究其体外释药特征。LIFU照射及加热条件下观察PTX-PLGA-SA/PFPs纳米粒体外增强超声显影情况及光镜下相变过程。DFY软件分析 LIFU致相变前后超声强度变化情况。②采用碳二亚胺法将抗CEA抗体（Ab）与PTX-PLGA/PFPs共价连接，制备出载抗 CEA抗体（Ab）的载药相变型纳米粒（PTX-PLGA-Ab/PFPs）作为直接靶向对照组。通过激光共聚焦显微镜分别观察PTX-PLGA-SA/PFPs与PTX-PLGA-Ab/PFPs上SA及Ab的连接情况，并通过流式细胞仪检测SA及Ab的连接率。③采用共聚焦激光显微镜及流式细胞术检测PTX-PLGA-SA/PFPs联合二步法预定位技术组（载药预定位靶向组）、PTX-PLGA-Ab/PFPs组（载药直接靶向组）、PTX-PLGA/PFPs组（载药非靶向组）及抗体阻断组对卵巢癌SKOV3细胞的体外寻靶效能，并通过CCK-8试剂法检测载药预定位靶向组、载药直接靶向组、载药非靶向组（PTX-PLGA/PFPs组）、单纯纳米粒组（PLGA/PFPs）、单纯药物组细胞存活率，评价 PTX-PLGA-SA/PFPs联合二步法预定位技术靶向杀伤癌细胞的能力。
　　结果：
　　⑴制备了 PTX-PLGA-SA/PFPs纳米粒，粒径为383.0±75.59 nm。光镜及电镜下观察到PTX-PLGA-SA/PFPs大小分布均匀，呈球形。PTX包封率和载药量分别为（71.56±6.51）%、（6.57±0.61）%。体外释药呈突释特征，释药率在2~3 d时达到70%以上。LIFU声功率为7.5W作用3min致相变后，可明显增强超声显像（*P＜0.05）。加至热45℃时纳米粒开始相变为微泡，当加热板温度到达60℃时，大部分纳米粒发生相变，且随着温度逐渐上升而发生破裂。⑵激光共聚焦显微镜下观察到呈红色荧光的PE标记的SA（PE-SA）成功连接到PTX-PLGA/PFPs上；FITC标记的呈绿色荧光的二抗与DiI标记的呈红色荧光的PTX-PLGA/PFPs融合，呈黄色荧光，说明Ab已成功与其连接。流式细胞仪测得纳米粒与链霉亲和素及抗体的结合效率分别为（97.16±1.20）%及（92.74±5.75）%。⑶体外寻靶实验结果表明，载药预定位组卵巢癌 SKOV3细胞的DiI标记的呈红色荧光的纳米粒明显多于载药直接靶向组、载药非靶向组及抗体阻断组，流式细胞术检测载药预定位组细胞平均荧光强度高于其余各组（*P＜0.05）。癌细胞杀伤实验中，载药预定位组细胞存活率低于其余各组（*P＜0.05），仅次于单纯药物组（*P＜0.05）。
　　结论：
　　①制备了链霉亲和素化的载紫杉醇相变型 PLGA纳米粒（PTX-PLGA-SA/PFPs），该纳米粒粒径分布均匀，紫杉醇包封率高，释药快，且释药率高。LIFU及加热可致其相变，且相变后可明显增强超声显影。链霉亲和素与该纳米粒连接效率高。②通过对比直接靶向方式，证实二步法生物素-链霉亲和素预定位技术能提高载紫杉醇相变型 PLGA纳米粒对体外卵巢癌细胞的靶向性及杀伤效能，为卵巢癌的超声分子靶向显影与治疗提供了一种新的可能途径。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 链霉亲和素化载药纳米粒的制备及体外特性研究

1 引言

2 材料

3方法

4 结果

5 讨论

6 小结

第二部分 预定位靶向卵巢癌细胞实验

1 引言

2 材料

3 方法

4 结果

5 讨论

6 小结

全文总结

参考文献

文献综述:载药PLGA纳米粒靶向肿瘤研究进展

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果