靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒的双模态显像及增强HIFU治疗实验研究

摘要

第一部分、靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒的制备、性能及相变研究
　　目的：制备一种靶向载硫化铋（Bi2S3）纳米颗粒及液态氟碳（PFH）的脂质纳米粒（Folate targeted Perfluorohexane lipid nanoparticles carrying bismuth sulfide,FLBS-PFH-NPs）,检测其基本性能、相变性能、体外寻靶性能、生物安全性及生物分布性能等。
　　方法：本部分采用薄膜水化法+乳化法制备FLBS-PFH-NPs造影剂，并对其形态结构，粒径，电位，元素组成，Bi含量等基本性质进行表征；于体外使用升温、高强度聚焦超声（HIFU）激发，观察制备的FLBS-PFH-NPs发生相变的情况；制备出DiI标记的带叶酸靶向的FLBS-PFH-NPs，然后与人宫颈癌Hela细胞和人正常肝脏L02细胞孵育验证该FLBS-PFH-NPs叶酸受体的靶向性能，并与不带叶酸的非靶向NLBS-PFH-NPs组比较；制备出不同浓度的FLBS-PFH-NPs与正常人肝细胞（L02）进行孵育，观察对细胞活性的影响；选取最大浓度的FLBS-PFH-NPs和PBS分别与正常人肝细胞（L02）孵育24h后用流式检测仪检测细胞的周期和凋亡情况；将FLBS-PFH-NPs从昆明小白鼠尾静脉注射后，观察不同时间点（7d，14d，30d）该脂质纳米粒对小白鼠的肝、肾、心功能的影响；于裸鼠尾静脉分别注射FLBS-PFH-NPs和NLBS-PFH-NPs后3 h取其心、肝、脾、肺、肾及肿瘤，溶于混合酸HClO4/HNO3并用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)检测各组织中Bi含量了解该纳米颗粒的生物分布情况；于健康兔耳缘静脉注射FLBS-PFH-NPs，取不同时间（2min,5min,10min,30min,1h,2h,4h,24h）兔血液检测其Bi含量，来计算其血液半衰期。
　　结果：本法制备的FLBS-PFH-NPs脂质纳米粒呈棕色乳液，光镜及透射电镜观察到形态呈球形，分散度较好，大小较均匀。透射电镜下可见大量Bi2S3颗粒分布于脂质外壳中。倒置荧光显微镜下该脂质纳米粒能散发出红色的荧光，说明FLBS-PFH-NPs具有荧光成像能力。FLBS-PFH-NPs粒径为（458.5±69.22）nm，表面电位为（-15.5±5.8）mV。能谱仪（EDS）和X射线衍射（XRD）检测到该纳米粒上有Bi和S元素的存在，进一步证明了Bi2S3被包裹于脂质壳膜上。加入不同体积的Bi2S3溶液(200,400,600,800 and1000μl)后ICP-OES测得样品中Bi含量分别为1.0,2.0,3.0,4.0，5.0mg/ml。当温度升高超过64℃或HIFU作用时，均能促进FLBS-PFH-NPs发生液气相变产生微泡，同时还能增强超声显影。激光共聚焦显微镜观察，靶向组可见到大量红色荧光的FLBS-PFH-NPs粘附于绿色荧光的细胞，而非靶向组（NLBS-PFH-NPs）未见到明显的纳米颗粒与细胞结合的趋势。流式检测到脂质纳米粒与细胞的连接率随着纳米粒浓度的增加而增加。而L02细胞组均未见FLBS-PFH-NPs和NLBS-PFH-NPs纳米粒结合细胞。MTT法测得吞噬后的FLBS-PFH-NPs脂质纳米粒对正常人肝细胞（L02）活性无明显影响。流式结果表明FLBS-PFH-NPs与细胞孵育后细胞周期正常，细胞凋亡率为7.88%，对照组PBS和细胞孵育后细胞凋亡率为7.48%，二者无明显差异。在选定观察时间范围内，所用浓度的FLBS-PFH-NPs对小鼠肝、肾及心功能无明显影响。裸鼠各组织中Bi元素的分布情况表明靶向组（FLBS-PFH-NPs）肿瘤纳米颗粒分布明显多于非靶向组（NLBS-PFH-NPs）。该FLBS-PFH-NPs的血液半衰期为2.2h。
　　结论：成功制备出形态较规则，分散性较好，大小较均匀，性质较稳定的，生物安全性好的靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒FLBS-PFH-NPs。该造影剂具有良好的相变能力，靶向能力，为下一步实验奠定了基础。
　　第二部分、靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒增强超声及CT显像实验研究
　　目的：观察FLBS-PFH-NPs于体内外对超声及CT成像效果的影响，探讨其多模态成像的可行性；同时观察了FLBS-PFH-NPs对裸鼠宫颈癌靶向成像的效果;了解FLBS-PFH-NPs双模态显像的能力及原理。
　　方法：本部分研究分为三部分进行。制备体外成像模型，应用超声诊断仪及CT扫描仪对不同浓度FLBS-PFH-NPs分别行超声及CT成像；正常新西兰大白兔12只随机分为四组，分别经兔耳缘静脉注入生理盐水、L-PFH-NPs、NLBS-PFH-NPs以及FLBS-PFH-NPs1ml/kg，然后用HIFU辐照(70W,2S),采集注射前及相变后兔肝超声图像，应用“DFY”软件测量兔肝辐照前后其声强及灰度变化。同样经耳缘静脉注射不同造影剂后行CT扫描，采集注射前及注射后不同时间点（30min,1h,2h）的兔肝CT图像，并应用图像分析软件测量肝实质的密度高低；建立裸鼠宫颈癌肿瘤模型12只，随机分为4组，经裸鼠尾静脉分别注射生理盐水、L-PFH-NPs、NLBS-PFH-NPs以及FLBS-PFH-NPs300μl，分别采集注射前及注射后3h肿瘤的超声及CT图像，并测量其回声强度及密度高低。
　　结果：体外超声显像，生理盐水无回声，L-PFH-NPs呈稍高回声，NLBS-PFH-NPs及FLBS-PFH-NPs呈高回声，回声强度随Bi2S3浓度的增加而增强；CT成像上，NLBS-PFH-NPs以及FLBS-PFH-NPs的CT密度明显高于生理盐水及L-PFH-NPs组，而且随Bi2S3含量增高，CT值逐渐升高；兔肝经HIFU作用后的超声图像显示，L-PFH-NPs、NLBS-PFH-NPs以及FLBS-PFH-NPs组兔肝的回声强度及灰度值明显高于生理盐水组及注射造影剂前(P＜0.05)；在CT显像中，NLBS-PFH-NPs以及FLBS-PFH-NPs组在注射后30min,1h,2h均能有效增强兔肝的CT成像对比度，CT值明显高于注射前、生理盐水及L-PFH-NPs组(P＜0.05)。在体内超声靶向成像中，靶向组(FLBS-PFH-NPs)裸鼠肿瘤的回声强度明显高于非靶向组（生理盐水、L-PFH-NPs、NLBS-PFH-NPs）(P＜0.05)。在体内CT靶向成像中，靶向组(FLBS-PFH-NPs)裸鼠肿瘤的CT成像效果最好，CT值明显高于非靶向组（生理盐水、L-PFH-NPs、NLBS-PFH-NPs）(P＜0.05)。
　　结论：FLBS-PFH-NPs具有能在体内外增强超声及CT双模显像的能力，是一种安全有效的多功能造影剂，对肿瘤的诊疗具有一定的应用价值。
　　第三部分、靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒增强HIFU治疗实验研究
　　目的：评价HIFU联合FLBS-PFH-NPs消融离体牛肝效果，探寻最佳辐照条件;并考察将其用于增效HIFU治疗裸鼠皮下宫颈癌移植瘤的消融效果，探讨其作为HIFU增效剂的应用价值。
　　方法：实验分两部分进行。第一部分为HIFU消融离体牛肝实验，取新鲜离体牛肝，局部注射不同造影剂生理盐水、L-PFH-NPs、NLBS-PFH-NPs及FLBS-PFH-NPs1ml后，给予不同输出声功率（90W，120W，150W，180W）HIFU作用2S，通过测量靶区凝固性坏死体积、灰度变化值及回声强度变化等指标来比较HIFU消融的增效效果。第二部分HIFU消融裸鼠宫颈癌实验，建立裸鼠宫颈癌模型12只，随机分为4组，HIFU+NACL组，HIFU+L-PFH-NPs组，HIFU+NLBS-PFH-NPs组，HIFU+FLBS-PFH-NPs，经尾静脉注射造影剂200μl后行HIFU定点辐照，工作参数为120W，2S。当辐照结束后，比较各组间靶区灰度变化值、解剖坏死体积、凝固性坏死体积、超微结构的变化，采集样品行HE染色，增殖细胞核抗原（PCNA）及细胞凋亡（TUNEL）检测。
　　结果：离体牛肝实验中，NLBS-PFH-NPs及FLBS-PFH-NPs组辐照区的灰度、回声强度变化值及凝固性坏死体积较注射生理盐水、L-PFH-NPs组明显增大（P＜0.05 ）；L-PFH-NPs组较注射生理盐水组增大（P＜0.05）,NLBS-PFH-NPs和FLBS-PFH-NPs组无明显的差异（P＞0.05）,随着HIFU作用的功率增加，辐照区的灰度、回声强度变化值及凝固性坏死体积也逐渐增大。HIFU消融裸鼠宫颈癌时，观察其灰度变化值和凝固性坏死区域，呈白色，未消融的肿瘤组织呈红色，分界清楚。4组中，靶向组FLBS-PFH-NPs的灰度变化值及凝固性坏死面积最大，明显高于其余3组非靶向组，差异显著，具有统计学意义（P＜0.05）。HE染色后光镜下观察，靶向FLBS-PFH-NPs组辐照区细胞结构基本消失，呈红染片状结构，坏死区与周围组织界限清楚。超微结构下可见癌细胞形态不清，结构消失，细胞膜和核膜失去连续性，染色质固缩、碎裂呈团块状，坏死更彻底。靶向组FLBS-PFH-NPs肿瘤细胞PCNA阳性表达率显著低于非靶向组（生理盐水、L-PFH-NPs及NLBS-PFH-NPs）（P＜0.05）。而靶向组FLBS-PFH-NPs肿瘤细胞凋亡指数（AI）明显高于非靶向组（生理盐水、L-PFH-NPs及NLBS-PFH-NPs）（P＜0.05）。
　　结论：FLBS-PFH-NPs是靶向叶酸受体性能较好的HIFU增效剂，能有效增强HIFU消融离体牛肝及裸鼠宫颈癌的生物学效应,其增强效果好于非靶向组的造影剂，为肿瘤的靶向诊疗奠定了基础。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒的制备、性能及相变研究

前言

1.1 主要仪器

1.2 主要试剂

1.3 细胞株

1.4 实验动物

1.5 实验方法

1.6 统计学方法

2 结 果

2.3 FLBS -PFH -NPs 脂质纳米粒的体外靶向性能

2.4 FLBS -PFH -NPs 脂质纳米粒的生物安全性能

2.4 FLBS -PFH -NPs 脂质纳米粒的生物分布及血液半衰期

3 讨 论

参考文献

附图

第二部分 靶向相变型载 Bi2S3脂质纳米粒增强超声及CT 显像实验研究

前言

第一节 靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒体外双模态显像实验

1材料与方法

2 结 果

3.讨 论

参考文献

附图

第二节 靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒增强兔肝超声及CT显像实验

1 材料与方法

2 结 果

3 讨论

参考文献

附图

第三节 靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒增强裸鼠宫颈癌超声及CT显像实验

前言

1 材料和方法

2 结 果

3讨 论

参考文献

附图

第三部分 靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒增强HIFU治疗实验研究

前言

第一节 靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒增效HIFU消融离体牛肝实验

1 材料与方法

2 结果

3讨 论

参考文献

附图

第二节 靶向相变型载Bi2S3脂质纳米粒增效HIFU消融裸鼠宫颈癌实验

1 材料和方法

2 结 果

3 讨 论

参考文献

附图

全文总结

文献综述:包裹液态氟碳的纳米粒的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文、参研项目、会议交流情况