当归多糖对5-氟尿嘧啶损伤骨髓基质细胞的保护作用

摘要

化疗作为恶性肿瘤综合治疗措施之一，在治疗的同时也带来各种不良反应，其中骨髓抑制尤为常见。临床上开展重组造血生长因子注射、造血干/祖细胞移植等方法，虽然可明显缩短肿瘤病人的骨髓抑制期，但仍不能完全恢复患者的造血功能和免疫功能，提示化疗可能损伤骨髓造血微环境，从而间接影响造血干/祖细胞的增殖、分化和成熟，导致造血功能障碍。目前基础实验和临床研究虽已初步证实体外扩增人骨髓基质细胞联合造血干细胞回输是受损骨髓造血重建的有效方法，但对于化疗导致骨髓造血微环境损伤及其影响造血细胞功能的机制尚不清楚。因此，深入研究化疗药物所致骨髓造血功能衰退的生物学机制，对缓解临床化疗副作用将有重要的现实指导意义。本研究以人骨髓来源基质细胞株 HS-5为研究对象，观察5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）对人骨髓造血微环境是否有损伤作用及其机制；以HS-5细胞为饲养层，建立人脐血单个核细胞和HS-5细胞共培养模型，初步探讨化疗药物作用后的骨髓基质细胞对造血细胞的影响及其可能机制。
　　当归多糖（angelica sinensis polysaccharides，ASP）是从祖国传统中药当归中分离、提取的有效药用成份，具有造血调控、免疫调节、抗辐射损伤和抗肿瘤等作用。本课题组既往实验发现ASP具有延缓辐射小鼠造血干细胞衰老的作用；同时ASP能延缓D-半乳糖诱导骨髓基质细胞的生理性衰老，从而促进造血细胞增殖分化。本研究进一步探讨了ASP对5-FU损伤的HS-5细胞的保护作用及其可能的生物学机制，以及ASP通过保护化疗后造血微环境进而改善骨髓造血功能的作用。本研究旨在为减轻临床化疗副反应提供实验依据和新的思路。
　　方法：
　　1.抑癌剂量5-FU体外作用人骨髓来源基质细胞株HS-5，探讨化疗药物5-FU对人骨髓基质细胞的影响。体外培养人乳腺癌细胞株MCF-7、人结肠癌细胞株 HCT-116及人骨髓基质细胞株HS-5，采用CCK-8法检测MCF-7、HCT-116、HS-5对不同浓度5-FU的敏感性。实验分组：对照组：常规培养48 h；12.5μg/ml组：常规培养体系内加入5-FU12.5μg/ml培养48 h；25μg/ml组：常规培养体系中加入5-FU25μg/ml培养48 h；50μg/ml组：常规培养体系中加入5-FU50μg/ml培养48 h；100μg/ml组：常规培养体系中加入5-FU100μg/ml培养48 h。以上不同浓度5-FU作用HS-548 h后，结晶紫染色计数成纤维细胞集落；流式细胞术分析细胞周期;Annexin V/PI双染及Hoechest染色检测凋亡。
　　2.ASP对5-FU损伤骨髓基质细胞的调控作用及其相关机制：选择25μg/ml5-FU作用HS-5细胞48 h进行后续实验。实验分为对照组、ASP组、5-FU组及ASP+5-FU组。对照组：常规培养48 h；ASP组：常规培养体系中加入ASP100μg/mL作用48 h；5-FU组:常规培养体系中加入5-FU25μg/ml作用48 h；ASP+5-FU组：ASP100μg/mL预处理HS-56 h后，再加入5-FU25μg/ml继续培养48 h。结晶紫染色计数成纤维细胞集落；流式细胞术分析细胞周期；Annexin V/PI双染检测细胞凋亡；β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞；DCFH-DA荧光染色流式检测胞内活性氧水平；酶学法检测超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶含量；流式细胞术分析胞内γH2AX表达水平；ELISA检测8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）的含量；ELISA及免疫荧光检测细胞因子SCF、GM-CSF、SDF、RANTS的含量；免疫荧光检测缝隙连接蛋白CX43的表达，荧光黄划痕传输技术测定CX43功能。
　　3.建立HS-5与人脐血单个核细胞（Human umbilical cord blood mononuclear cell，hUCB-MNC）体外共培养模型，观察损伤骨髓基质细胞对造血细胞的影响以及当归多糖的调控作用：制备HS-5饲养层，实验分为对照组、ASP组、5-FU组及ASP+5-FU组。对照组:常规培养48 h；ASP组：常规培养体系中加入ASP100μg/mL作用48 h；5-FU组:常规培养体系中加入5-FU25μg/ml作用48 h；ASP+5-FU组：ASP100μg/mL预处理HS-5细胞6 h后，再加入5-FU25μg/ml继续培养48 h。采用Ficoll密度梯度离心法分离hUCB-MNC，贴壁培养6 h后，去除hUCB-MNC内的脐血基质细胞，收集悬浮造血细胞，调整细胞浓度，以1×106/ml分别与四组饲养层HS-5共培养。48 h后收集造血细胞以作后续检测：采用台盼蓝染色计数活细胞；流式细胞术检测细胞周期、ROS水平、CD34+细胞百分率；酶学法检测谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）含量；β-半乳糖苷酶染色检测衰老hUCB-MNC。
　　结果：
　　1.5-FU12.5～100μg/ml对MCF-7、HCT-116、HS-5均有增殖抑制作用，且该作用具有浓度依赖性和时间依赖性，其中HS-5对5-FU作用更敏感。不同浓度的5-FU作用后，HS-5细胞成纤维细胞集落计数减少；细胞发生周期阻滞，G0/G1期的细胞比例升高，S期的细胞比例下降；凋亡率上升。
　　2.5-FU损伤HS-5细胞，成纤维细胞集落计数减少；细胞周期阻滞于G1期，S期的细胞比例下降；凋亡率增加；衰老细胞染色阳性率升高；细胞抗氧化能力降低，胞内ROS水平显著增高；DNA损伤指标γH2AX和8-OHdG含量升高；缝隙连接蛋白CX43表达减少，细胞间传输能力降低；分泌正向造血调控因子 SCF、GM-CSF、SDF-1显著降低，炎性因子RANTES分泌显著升高。在5-FU作用前以当归多糖预处理HS-5细胞，成纤维细胞集落计数显著升高；细胞阻滞减轻；凋亡率显著降低；衰老细胞阳性率降低；细胞抗氧化能力增强，胞内ROS水平降低；γH2AX和8-OHdG的含量显著降低；Cx43蛋白表达及功能回升；SCF、GM-CSF、SDF-1分泌增多，RANTES分泌量减少。
　　3.与对照组相比，和5-FU组HS-5共培养后的hUCB-MNC活细胞数量及CD34+细胞比例降低；hUCB-MNC发生 G1期阻滞；细胞抗氧化能力降低，胞内ROS含量显著上升；且衰老的hUCB-MNC数量显著增加。与5-FU组共培养的hUCB-MNC相比较，与ASP+5-FU组共培养后hUCB-MNC活细胞计数及CD34+细胞比例显著增加；G0/G1期细胞比例下降，S期细胞比例升高；细胞抗氧化能力增强，胞内ROS水平降低；衰老细胞阳性率下降。
　　结论：
　　1.抑癌浓度的5-FU显著抑制骨髓基质细胞增殖，细胞发生凋亡和衰老。
　　2.5-FU改变骨髓造血微环境：5-FU诱发骨髓基质细胞氧化损伤；细胞间连接蛋白表达下调、细胞间通讯功能降低；分泌生物活性物质改变。
　　3.5-FU损伤的造血微环境诱发造血细胞氧化应激性早衰。
　　4.ASP可通过减轻5-FU对造血微环境的损伤而延缓造血细胞氧化应激性早衰，其机制可能与ASP减轻骨髓基质细胞氧化应激、上调细胞间通讯功能、促进造血正向调控因子分泌有关。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1.1实验材料

1.2 实验方法

1.3免疫荧光检测造HS-5细胞的ROS含量

2 结果

2.1抑癌剂量5-FU抑制人骨髓基质细胞增殖

2.2 5-FU促进人骨髓基质细胞周期阻滞和凋亡

2.3 当归多糖抑制5-FU所致人骨髓基质细胞凋亡及衰老

2.4 当归多糖减轻5-FU所致人骨髓基质细胞氧化应激

2.5当归多糖促进人骨髓基质细胞细胞间通讯

2.6 当归多糖减轻5-FU诱导的人骨髓基质细胞DNA损伤

2.7当归多糖对人骨髓基质细胞产生细胞因子的影响

3 讨论

参考文献

第二部分 当归多糖调控骨髓基质细胞损伤对脐血造血细胞氧化应激的影响

前言

1 实验材料和方法

1.1实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学分析

2结果

2.1当归多糖调控骨髓基质细胞减轻脐血造血细胞增殖抑制

2.2 当归多糖调控骨髓基质细胞延缓脐血造血细胞衰老

2.3当归多糖调控骨髓基质细胞减轻脐血造血细胞氧化应激

3 讨论

参考文献

全文总结

文献综述化:疗药物对骨髓造血微环境的影响

致谢

攻读学位期间研究成果与发表的学术论文