睾丸间质细胞Prl3c1过表达转基因小鼠建立与生物学功能初步研究

摘要

目的：Prolactin family3,subfamily c,member1(Prl3c1)是泌乳素（PRL）家族成员之一。与大多数PRL家族成员不同，Prl3c1是一种新型催乳素样基因，主要在雌性胚胎植入位点的蜕膜细胞表达，对妊娠维持起重要作用。本课题组前期发现Prl3c1表达于雄性睾丸间质细胞中并且18天C57BL/6雄性小鼠组的Prl3c1 mRNA和蛋白表达低，成年组表达增加达高峰，老年组表达降低。鉴于Prl3c1表达水平与体内睾酮水平随年龄变化趋势一致，推测其体内功能可能与间质细胞功能有关。因此本研究拟建立睾丸间质细胞 Prl3c1过表达转基因小鼠并对其生物学功能进行初步研究。
　　方法：
　　1.设计引物扩增insulin like3(Insl3)、Prl3c1、Insl3PA片段，通过融合PCR，形成Insl3-Flag-Prl3c1-Insl3PA片段，构建pPrl3c1转基因载体，测序验证。
　　2.用受精卵原核显微注射法建立Prl3c1转基因小鼠模型。
　　3.用免疫荧光和western blot方法鉴定Prl3c1转基因表达情况。
　　4.用HE染色的方法观察Prl3c1转基因小鼠睾丸形态学改变情况。
　　5.采用ELISA方法检测3月龄转基因小鼠与野生型对照小鼠血清睾酮水平（n=6）。用Western blotting分析hCG诱导的睾酮产生的机制。
　　结果：
　　1.成功的构建了pPrl3c1转基因载体。
　　2.通过原核受精卵显微注射法成功的构建了Prl3c1转基因小鼠模型，筛选出3只Prl3c1过表达转基因F0代小鼠。
　　3.免疫荧光与western blot实验结果显示转基因片段表达于睾丸间质细胞。
　　4.HE染色实验结果显示Prl3c1转基因小鼠睾丸形态学未见明显改变。
　　5.ELISA结果显示Prl3c1睾酮水平与野生对照小鼠无明显差异[(2.61±0.34)ng/mL vs(2.51±0.35)ng/mL,P＞0.05]，但在HCG刺激下，其水平低于野生对照组[(5.35±0.83)ng/mL vs(7.56±1.17)ng/mL,P＜0.01]。Western blot实验结果表明Prl3c1过表达减弱 HCG刺激的STAR表达（P＜0.01）。
　　结论：成功构建了睾丸间质细胞Prl3c1转基因小鼠模型，体内功能研究显示Prl3c1参与睾酮产生。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 睾丸间质细胞Prl3c1过表达转基因小鼠建立

1材 料

1.1实验动物

1.2主要试剂

1.3主要仪器与设备

1.4主要溶液配制

2方 法

2.1转基因载体构建思路

2.2目的片段的获取

2.3受精卵原核显微注射法制备转基因小鼠

2.4 PCR鉴定Prl3c1转基因首建鼠

2.5 Prl3c1转基因小鼠的繁殖与鉴定

3结 果

3.1目的片段的获取结果

3.2融合片段的获取结果

3.3 EGFP片段的获取结果

3.4 18T-EGFP载体构建结果

3.5载体酶切鉴定及片段回收结果

3.6 pPrl3c1转基因载体的构建及鉴定

3.7 PCR法鉴定筛选Prl3c1过表达小鼠及PCR测序结果

4讨 论

5小 结

第二部分 Prl3c1转基因小鼠的生物学功能初步研究

1材 料

1.1实验动物

1.2主要试剂

1.3主要仪器与设备

1.4主要溶液配制

2方 法

2.1小鼠睾丸组织中的免疫荧光

2.2 HE染色

2.3 ELISA检测血清睾酮含量

2.4 Prl3c1在睾丸组织中的蛋白表达

2.5统计学分析

3结 果

3.1免疫荧光鉴定Prl3c1转基因构建体在睾丸间质细胞中的表达

3.2 Western blot鉴定Prl3c1转基因构建体在睾丸间质细胞中的表达

3.3 HE分析

3.4上调Prl3c1基因不影响睾酮基础水平，但减弱HCG诱导的睾酮产生

3.5 Prl3c1过表达抑制HCG诱导的STAR表达上调

4讨 论

5小 结

全文总结

参考文献

文献综述:Prl3c1基因的研究进展

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文