αB-crystallin介导HSF1活化卵巢癌间质癌相关成纤维细胞的功能及其对卵巢癌细胞恶性行为的影响

摘要

目的：热休克因子HSF1能够编程肿瘤间质细胞从而促进恶性肿瘤形成;前期实验表明HSF1能够活化卵巢癌间质成纤维细胞并促进卵巢癌迁移侵袭潜能;但机制尚不清楚。晶状体蛋白αB（αB-crystallin）属于小分子热休克蛋白家族;最早发现于脊椎动物眼睛晶状体;αB-crystallin 表达增加与肿瘤发生、发展相关。本文旨在研究αB-crystallin 介导 HSF1 活化卵巢癌间质成纤维细胞的可能机制及αB-crystallin对卵巢癌细胞本身增殖及浸润的影响。 方法：分为两个部分：一、探讨αB-crystallin参与HSF1活化卵巢癌间质成纤维细胞的功能：1.从正常卵巢及卵巢癌新鲜标本中分别分离提取正常成纤维细胞（normal fibroblasts; NFs）和CAFs;qRT-PCR测定NFs和CAFs中αB-crystallin和HSF1的表达;2.免疫组化检测在人正常卵巢组织和卵巢癌组织中;αB-crystallin和HSF1在上皮和间质中的表达;分析二者的关联性;3.针对蛋白αB-crystallin的基因（CRYAB基因）设计合成靶向小干扰RNA (siRNA) 重组慢病毒;并感染人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株 SKOV3;4.构建 SKOV3-NC（对照组）、SKOV3-iHSF1（敲低HSF1）和SKOV3-iCRYAB（敲低CRYAB）三种细胞的小鼠异种移植瘤;Masson 三色染色检测对间质的募集情况;5.免疫荧光测定αB-crystallin和HSF1蛋白在HEY和SKOV3细胞中的定位表达;6.免疫沉淀（IP）验证αB-crystallin和HSF1是否有相互结合。 二、探讨 αB-crystallin 对卵巢癌细胞恶性行为的影响：1. TCGA数据库和Kaplan-Meier Plotter分析αB-crystallin表达与浆液性卵巢癌手术-病理分期的相关性及其对浆液性卵巢癌生存的影响;2.对SKOV3-NC和SKOV3-iCRYAB两组细胞;运用流式细胞仪、平板克隆、MTT检测细胞凋亡和增殖;Transwell检测细胞迁移和侵袭能力;通过Western blot 检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9 （MMP-9）的表达;分析其可能机制。 结果：一、αB-crystallin参与了HSF1活化卵巢癌间质成纤维细胞的功能：1. αB-crystallin和HSF1在CAFs中的表达均高于NFs;且二者表达强度具有一致性;2. 在卵巢癌组织中;αB-crystallin和HSF1在上皮和间质中均呈明显高表达;特别是在II型卵巢癌组织中更为明显;3. 在 SKOV3-NC （对照组）、SKOV3-iHSF1 （敲低 HSF1 ）和SKOV3-iCRYAB （敲低 CRYAB ）三种细胞的小鼠异种移植瘤中; Masson染色表明干扰HSF1或CRYAB之后;肿瘤细胞对间质募集能力降低;4. 免疫荧光显示在 HEY 和 SKOV3 细胞中 αB-crystallin 和HSF1 蛋白定位表达具有一致性;5.IP 结果表明 αB-crystallin 和 HSF1有内源性结合。 二、αB-crystallin对卵巢癌细胞恶性行为的影响：1.TCGA数据库和 Kaplan-Meier Plotter 分析表明;在浆液性卵巢癌中;高表达αB-crystallin患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）短于低表达 αB-crystallin 患者;且 αB-crystallin 表达水平与浆液性卵巢癌手术-病理分期存在一致性;2.感染CRYAB siRNA慢病毒后;SKOV3细胞内 αB-crystallin 蛋白表达降低 64%; 其凋亡和增殖无明显改变;但SKOV3 细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制;Western Blot 测定 MMP相关蛋白的表达;结果表明敲低αB-crystallin使蛋白MMP-2和MMP-9表达下调。 结论: 晶状体蛋白αB-crystallin可能参与了HSF1诱导卵巢癌间质中CAFs活化这一过程;同时对卵巢癌细胞迁移侵袭也具有促进作用。

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