PKCβ/p66Shc介导高水平尿素引起人脐静脉内皮细胞ROS和炎症的产生

摘要

心血管病（cardiovascular disease，CVDs）是终末期肾脏疾病(End Stage Renal Disease，ESRD)患者最常见的并发症以及最主要的死亡原因，其致死率比其它并发症高10～20倍[1]。而ESRD并发CVDs中又以动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）多见[2]。ESRD患者存在多种导致心血管疾病的危险因素，如吸烟、高血压、糖尿病、肥胖和血脂异常等，但这些传统的危险因素并不能完全解释在 ESRD患者并发CVDs特别是AS的高发性和较高的死亡率[3-6]，因此，研究AS的病理改变机制对于提高ESRD患者的生存和生活质量十分重要。
　　氧化应激作为重要危险因素在CVDs特别是AS的发病机制中具有重要作用。血管壁ROS的大量产生不仅可导致一氧化氮（nitric oxide，NO）生物利用度降低而引起内皮功能障碍，并且可损伤血管壁结构而促进AS的形成[7,8]。炎症（inflammatory）在AS的形成中的重要作用也不容忽视[9,10]。炎症早期可募集免疫细胞至动脉，晚期可激活动脉壁的 T细胞产生并分泌炎性细胞因子，促进炎症的发生发展[11]。有研究表明，高水平尿素可诱发脂肪细胞的氧化应激和功能障碍，引发胰岛素抵抗[12]。ESRD患者体内的血尿素水平会随着肾功能进行性下降而不断增高；高尿素水平是否为诱导血管内皮细胞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）大量产生以及促进炎症发生的重要病理因素，其机制如何？目前尚不清楚。
　　衔接蛋白p66Shc是由原癌基因ShcA编码、广泛表达于哺乳动物细胞内有调节线粒体功能的蛋白，介导了包括高血糖、同型半胱氨酸等多种病理因素所诱导的血管内皮功能失常[13]。而PKCβ是介导p66Shc蛋白磷酸化及其线粒体转位的关键蛋白[14]，PKCβ/p66Shc/mCyt.C复合物的形成在PKCβ介导的细胞氧化损伤中起到关键作用[15]。我们在前期工作中发现高尿素可诱导p66Shc磷酸化水平的增高，那么，高尿素是否通过PKCβ/p66Shc通路诱导ROS的大量产生和炎症的发生？因此，本研究拟采用体外实验验证以上假设。
　　目的：
　　探讨PKCβ/p66Shc通路在高水平尿素引起人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）、ROS和炎症产生中的作用。
　　方法：
　　体外培养HUVECs，分为正常对照组、甘露醇组、尿素组和尿素+PKCβ抑制剂(LY333531)组。采用CCK-8法检测高水平尿素对HUVECs活性的影响，倒置显微镜观察细胞形态的改变；DCFH-DA法检测细胞内ROS含量；免疫荧光技术观察细胞内p-p66Shc、TNFα和ICAM-1的表达；Western blot检测细胞中p66Shc、p-p66Shc、PKCβ、p-PKCβ、TNFα、ICAM-1、iNOS和eNOS的表达水平。
　　结果：
　　1.25mmol/L尿素明显抑制HUVECs活力，引起细胞排列紊乱，细胞间隙增大，铺路石样排列结构受到破坏等形态学改变。
　　2.与对照组相比，25 mmol/L尿素引起细胞内ROS水平明显升高，在6 h达到峰值（P＜0.05）；加入PKCβ抑制剂LY333531后ROS水平明显降低（P＜0.05）。
　　3.25 mmol/L尿素负荷6 h后可见细胞胞浆内p-p66Shc、TNFα和ICAM-1荧光强度明显增强；与此同时，尿素可诱导p-PKCβ、p-p66Shc、TNFα、ICAM-1和iNOS蛋白的表达呈时间依赖性增加，其中p-p66Shc6 h组与对照组相比，升高了约76%（P＜0.01），24 h时升高了约2倍（P＜0.01）；p-PKCβ与对照组相比，24 h时升高了约64%（P＜0.05）。TNFα与对照组相比，6 h增加了约40%，24 h增加了约一倍（P＜0.05）；ICAM-1在6 h增加了约80%，24 h增加了约2倍（P＜0.05）；iNOS24 h升高了约1倍（P＜0.05）；eNOS与对照组相比，12 h下降了约34%（图7B，P＜0.05），24 h下降了约56%（P＜0.01）
　　4.加入LY333531后p-p66Shc、TNFα和ICAM-1荧光强度降低，同时，Western blot结果显示，p-p66Shc、TNFα、ICAM-1蛋白表达下调，p-p66Shc蛋白的表达水平与对照组相比，降低了约40%（P＜0.05）；与6 h组相比，TNFα减少了约61%（P＜0.05）；ICAM-1减少了约94%（P＜0.01）；eNOS与6 h组相比，蛋白表达水平提高了约50%（P＜0.01）。
　　结论：
　　PKCβ/p66Shc信号通路是高水平尿素诱导HUVECs内ROS和炎症产生的重要途径。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1材料和方法

1.1细胞及主要试剂材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 高水平尿素抑制HUVECs活力

2.2 高水平尿素负荷引起HUVECs形态的改变

2.3 高水平尿素诱导HUVECs中ROS的产生

2.4 PKCβ抑制剂减少高水平尿素诱导的HUVECs中ROS的产生

2.5 高水平尿素激活PKCβ/ p66Shc信号通路

2.6 LY333531抑制高水平尿素引起的HUVECs中p-p66Shc的表达

2.8 PKCβ抑制剂降低HUVECs中TNFα和ICAM-1的表达

3 讨论

全文总结

附插图：

参考文献

文献综述:PKC和p66Shc在氧化应激介导的心血管病中的作用

致谢

硕士期间发表的论文