精氨酸酶抑制剂nor-NOHA诱导HepG2肝癌细胞凋亡并抑制其侵袭和迁移

摘要

背景：
　　肝细胞肝癌是常见的恶性肿瘤之一，在全球癌症死因中位列第三。我国是肝病大国，为肝癌的高发区。由于肝癌易转移、复发率高，且对放化疗不敏感，导致其治疗效果和预后都很差。因此，如果能寻找到可以有效的抑制肝癌转移、增强肝癌对放化疗敏感性的新型药物，这将在改善肝癌的预后方面具有重要的意义。精氨酸酶（Arg）不仅可以通过分解 L-精氨酸产生尿素和鸟氨酸参与体内氨解毒过程，而且还可以通过其下游产物促进组织再生、细胞增殖等参与炎症触发的肿瘤免疫逃逸、纤维化、免疫抑制等病理过程。一氧化氮合酶（NOS）可与Arg竞争底物L-精氨酸，产生一氧化氮（NO）。NO在肿瘤的起始、进展和转移等多个重要的肿瘤相关过程中都扮演着非常重要的作用：NO对肿瘤的作用依赖于其浓度水平，低浓度的NO可以促进肿瘤的进展；而高浓度的NO则发挥细胞毒作用，可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的进展和转移。但是抑制Arg后能否增加NOS的表达，从而产生高浓度的NO达到抑制肿瘤的目的尚不清楚。
　　目的：
　　通过观察精氨酸酶抑制剂nor-NOHA对HepG2肝癌细胞增殖和凋亡的影响，以及对HepG2肝癌细胞侵袭和迁移的影响，来探讨nor-NOHA对HepG2肝癌细胞的具体作用并初步探索其机制。
　　方法：
　　采用CCK-8法检测（0.0、0.5、1.0、2.0、3.0）ng/μL nor-NOHA作用后人肝癌HepG2细胞增殖的情况；流式细胞术检测nor-NOHA对HepG2细胞凋亡的影响。Western blot法检测nor-NOHA对细胞内精氨酸酶-1（Arg-1）、p53、基质金属蛋白酶2（MMP-2）以及上皮钙黏素（E-cad）蛋白表达的影响；实时荧光定量 PCR检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达；Griess法检测各组 HepG2细胞产生的一氧化氮（NO）浓度；Transwell实验及细胞划痕实验测定HepG2细胞的侵袭、迁移能力。
　　结果：
　　⑴通过CCK-8实验发现，浓度为1.0、2.0、3.0ng/μL的 nor-NOHA处理的 HepG2细胞组的存活率较对照组明显降低（P＜0.05）；通过流式细胞术发现，nor-NOHA组细胞凋亡率较对照组明显升高（P＜0.05）。⑵Western-blot结果发现，nor-NOHA组HepG2细胞内p53、E-cad表达较对照组明显升高（P＜0.05），Arg-1、MMP-2表达明显降低（P＜0.05）。⑶实时定量 PCR结果显示，nor-NOHA处理组的 iNOS mRNA的表达较对照组明显升高（P＜0.05）。Griess法检测结果表明，经nor-NOHA处理后，HepG2细胞产生的NO显著增加（P＜0.05）。⑷Transwell实验及细胞划痕实验证实，nor-NOHA处理组HepG2细胞的迁移侵袭能力较对照组明显降低（P＜0.05）。
　　结论：
　　①nor-NOHA抑制HepG2细胞的增殖并诱导其凋亡,这个过程与高浓度的NO上调p53蛋白的表达有关。②nor-NOHA通过下调Arg的表达，使iNOS表达升高产生高浓度的NO，从而使E-cad表达增高、MMP-2表达降低，导致HepG2细胞的侵袭和迁移能力下降。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1 材料

1.1细胞株来源

1.2实验主要试剂

1.3主要仪器

1.4实验主要试剂的配置

2实验方法

2.1细胞培养

2.1 细胞CCK-8实验测HepG2细胞增殖

2.2 流式细胞术检测HepG2细胞凋亡

2.3 蛋白免疫印迹（western blot ）法检测HepG2细胞内各蛋白表达情况

2.4 荧光定量PCR检测检测HepG2肝癌细胞iNOS mRNA水平

2.5 Griess法检测HepG2细胞上清液NO浓度

2.6 Transwell实验检测HepG2细胞的侵袭能力

2.7 细胞划痕实验检测HepG2细胞的迁移能力

2.8 统计学分析

3结果

3.1 nor-NOHA对HepG2细胞增殖的抑制作用

3.2 nor-NOHA对HepG2细胞凋亡的促进作用

3.3 各组HepG2细胞内iNOS mRNA的表达水平

3.4 各组HepG2细胞内Arg-1、P53、MMP-2、E-cad蛋白的表达水平

3.5 各组HepG2细胞内一氧化氮的浓度

3.6 nor-NOHA抑制HepG2细胞的侵袭

3.7 nor-NOHA处理后HepG2细胞的迁移能力

4讨论

全文总结

综述:一氧化氮合酶及一氧化氮与肿瘤关系的研究进展

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文