HGF调控VECs凋亡信号通路在闭合性周围血管损伤模型中的研究

摘要

目的:揭示HGF与VECs凋亡途径的内在联系，探讨HGF抑制闭合性周围血管损伤中VECs凋亡，促进其修复和再生的应用价值，为进一步探索闭合性血管损伤的治疗提供新的方向。 方法：本课题拟采用腔内介入法建立闭合性周围血管损伤动物实验模型，用TUNNEL法检测动物模型VECs凋亡指数，评估模型可靠性。选择慢病毒作为载体介导HGF基因转染新西兰家兔VECs，构建Lv-GFP（携带绿色荧光蛋白的重组慢病毒,用于测定转染率）和GFP-Lv-HGF（携带肝细胞生长因子基因和绿色荧光蛋白的重组慢病毒）两种内皮细胞系，成功转染后用荧光显微镜观察转染细胞中GFP的表达情况，评估转染有效性。45只新西兰雌性家兔分为：A组：股动脉损伤+GFP-Lv-HGF处理组15只； B组：股动脉损伤+Lv-GFP处理组15只；C组：正常空白对照组15只。显露A、B组损伤段股动脉，用毛细针头将体外实验HGF基因转染成功的VECs注入动脉壁下及血管周围组织间隙内，分别于注射术后第1、3、5天每组分别取5只处死，分离出手术段股动脉。使用western blot及免疫荧光方法检测bax蛋白、caspase3、8、9，Ask1、JNK等凋亡相关蛋白表达情况。 结果：利用血管腔内介入法可以建立可靠的兔股动脉内膜损伤模型，并为体内外实验提供了转染细胞；HGF表达可以下调凋亡相关蛋白 caspase3、caspase8、caspase9的表达，上调 Bcl-2，Bcl-xl表达水平；HGF表达上调可以抑制Fas/FasL表达，从而抑制Fas/FasL级联通路的激活，显著降低VECs凋亡，促进VECs增殖。此外，HGF还能抑制ASK1-JNK介导的凋亡信号转导通路进而促进VECs增殖。结论：本实验证实HGF通过调控Fas/FasL级联信号通路参与抑制VECs凋亡，促进外周血管新生，为进一步探索闭合性周围血管损伤的治疗提供新的方向。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

1材料

1.1核酸合成及测序：

1.2慢病毒转染RNA序列：

1.3实验动物:

1.4 动物模型建立

1.5细胞培养相关使用材料：

1.6 Western印迹相关试剂：

1.7抗体：

1.8 HGF转染：

1.9实验仪器：

1.10常用缓冲液及细胞培养基的配制

2 方法与步骤

2.1 实验动物模型的建立

2.2评估动物模型可靠性

2.3 HGF慢病毒载体构建及包装

2.4慢病毒介导HGF基因转染VECs体外实验研究

2.5慢病毒介导HGF基因转染VECs体内实验研究

2.6Western Blot检测

2.7组织免疫荧光染色

3 结 果

3.1兔股动脉内膜损伤模型的建立与家兔VECs的分离采集与体外培养

3.2慢病毒介导HGF基因转染VECs体外实验研究

3.3慢病毒介导HGF基因转染VECs动物模型体内研究

3.4 HGF抑制血管闭合性损伤家兔VECs凋亡的信号转导机制

4 讨 论

参考文献

文献综述:肝细胞生长因子抑制血管内皮细胞凋亡的机制

致谢

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