2型糖尿病患者血清Klotho蛋白水平变化与视网膜病变的关系及机制研究

摘要

第一部分、2型糖尿病患者血清Klotho蛋白水平变化与视网膜病变及氧化应激指标之间的相关性
　　目的：观察2型糖尿病患者血清Klotho（KL）蛋白水平变化及与视网膜病变（DR）、氧化应激指标之间的相关性。
　　方法：选取17例健康者（NC组）与60例2型糖尿病患者（DM组）作为研究对象，对DM组患者行荧光素眼底血管造影检查，根据有无合并视网膜病变以及病变的严重程度，分为不合并视网膜病变的糖尿病组（NDR组）、非增殖期糖尿病视网膜病变组（NPDR组）及增殖期糖尿病视网膜病变组（PDR组）。收集研究者的人体测量学及生化指标，计算身体质量指数（BMI）。留取静脉血分离血清标本，利用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定血清KL蛋白水平，硫代巴比妥酸法测定血清丙二醛（MDA）含量，黄嘌呤氧化酶法测定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性。比较各组间血清KL蛋白变化，分析KL蛋白与DR及SOD、MDA之间的相关性。
　　结果：
　　（1）各组间血清 KL蛋白水平比较：与NC组相比，血清KL蛋白水平在DM组明显降低。亚组分析结果显示，血清KL蛋白水平在NDR、NPDR及PDR三组间呈逐渐降低趋势，组间比较具有统计学差异。
　　（2）血清KL蛋白与DR相关性分析：Spearman分析显示，血清KL蛋白与DR之间呈显著负相关。Logistic回归分析发现，KL蛋白水平降低是DR的独立危险因素。
　　（3）各组间氧化应激指标比较：与NC组相比，血清SOD活力在DM组显著下降，而MDA含量显著升高，差异具有统计学意义。在NDR、NPDR及PDR亚组中，SOD活力逐渐降低，MDA含量逐渐升高，组间差异具有统计学意义。
　　（4）血清KL蛋白与SOD、MDA之间相关性分析：在糖尿病人群中，Spearman分析显示，血清KL蛋白与SOD活力呈显著正相关，而与MDA呈显著负相关。进一步行多元线性逐步回归分析，结果显示，血清KL蛋白水平与SOD之间呈独立正相关关系。
　　结论：KL蛋白在糖尿病患者血清中表达水平显著降低，且随视网膜病变程度的加重呈逐渐降低趋势，是DR的独立危险因素。糖尿病患者体内氧化能力增强，抗氧化能力减弱，血清KL蛋白水平与SOD之间密切相关。
　　第二部分、Klotho蛋白对棕榈酸诱导的人视网膜内皮细胞凋亡及活性氧产生的影响及机制探究
　　目的：体外给予重组Klotho（KL）蛋白干预，观察KL蛋白对棕榈酸（PA）诱导的人视网膜内皮细胞（HRECs）凋亡和活性氧（ROS）产生的影响，并进行机制探究。
　　方法：体外利用葡萄糖浓度为15mmol/L的培养基为背景，模拟糖尿病状态下的高糖环境，培养HRECs细胞，然后将细胞随机分为对照（Ctr）组、PA组、PA+KL组及PA+KL+LY294002组，干预24小时后收集细胞，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，提取蛋白行W检测凋亡相关指标Bax、Bcl-2及Cleaved-caspase3的蛋白表达水平，DCFH-DA（2’7’-dichlorofluorescein diacetate）法检测细胞内ROS水平。
　　结果：与Ctr组相比，流式细胞术检测结果显示，PA组细胞凋亡率显著增高（P＜0.05）。Western blot数据示PA组抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3表达升高，Bcl-2/Bax比值下降（P＜0.05）。另外，DCFH-DA荧光染色示PA组细胞内ROS水平升高。以上数据提示PA能够成功诱导HRECs细胞凋亡及ROS产生。给予KL蛋白处理后，结果显示PA诱导的细胞凋亡率显著下降，Bcl-2表达上调，Bax及Cleaved-caspase3表达下调，Bcl-2/Bax比值升高（P＜0.05），同时细胞内ROS水平减弱。提示KL蛋白能够对抗PA对细胞的损害作用。此外结果显示，PA干预后细胞p-Akt蛋白表达水平显著下降（P＜0.05），而给予KL蛋白处理后p-Akt蛋白表达水平显著恢复（P＜0.05）。随后给予PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002处理，结果示KL蛋白对PA诱导的细胞凋亡及ROS产生的抑制作用明显减弱，提示KL蛋白能够通过激活PI3K/Akt信号通路发挥细胞保护作用。
　　结论：KL蛋白能够明显抑制PA诱导的HRECs细胞凋亡及ROS产生，且该抑制作用可能是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分2型糖尿病患者血清Klotho蛋白水平变化与视网膜病变及氧化应激指标之间的相关性

1前言

2对象与方法

3结果

4讨论

参考文献

第二部分Klotho蛋白对棕榈酸诱导的人视网膜内皮细胞凋亡及活性氧产生的影响及机制探究

1前言

2材料与方法

3结果

4讨论

参考文献

全文总结

本课题的创新性、不足和后续科研工作的设想

创新性

不足及后续科研工作设想

文献综述：可溶性Klotho蛋白研究新进展

致谢

攻读博士学位期间发表的论文