TRPC3通道经ERK信号通路对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

摘要

研究背景：
　　新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是指各种原因所致围生期窒息、缺氧引起的胎儿或新生儿脑损伤，是新生儿时期致死和致残的重要原因之一，临床上尚缺乏有效的治疗措施。缺氧缺血诱导的神经元坏死和凋亡是引起脑组织损伤的最重要原因，因此，减少神经元坏死和凋亡，促进其生存，是防治缺氧缺血所致神经系统损伤的重要策略之一。
　　经典瞬时受体电位3（transient receptor potential canonical3，TRPC3)通道是在胎儿期和围生期中枢神经系统中广泛表达的非特异性阳离子通道，参与包括心脑血管疾病在内的体内众多生理和病理过程。有研究证明，TRPC3是细胞内钙稳态的重要调节者，可以调节包括细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路在内的多条钙敏感胞内信号转导通路的活性，最终影响神经元的生存或死亡。
　　细胞外信号调节激酶是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，属于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）家族成员。ERK的激活是胞外信号从细胞膜转导至细胞核内的关键，因其参与了细胞增殖、分化、生存与凋亡而受到广泛关注。已有证据表明在缺氧缺血性损伤发生时，该通路是介导神经元生存的重要途径，当其激活时具有神经保护作用，受到抑制时则可加重脑组织的损伤。ERK信号通路受到多种因子的调控，其中胞内游离钙离子浓度是影响ERK活性的重要信号事件之一。已有研究发现作为胞内钙离子浓度重要调节者的TRPC通道，在多种损伤或刺激因素的作用下，参与了ERK通路的激活，从而发挥其减少凋亡、促进生存的作用。但是关于TRPC3通道在新生动物HIBD中的作用及其与ERK通路关系的研究尚未见报道。
　　本课题围绕TRPC3通道、Ca2+和ERK信号通路，初步探讨TRPC3在HIBD中的作用及其可能的机制。
　　第一部分 TRPC3通道对大鼠皮层神经元OGD/R损伤的保护作用目的
　　采用原代培养皮层神经元OGD/R模型，探讨TRPC3通道对大鼠皮层神经元OGD/R损伤的保护作用。
　　方法：
　　1．模型：对原代培养的SD大鼠皮层神经元，采用氧糖剥夺（Oxygen-glucose deprivation，OGD）1.5 h复糖氧24 h的方法制备大鼠皮层神经元OGD/R模型。
　　2．分组
　　①选择性阻断剂Pyr3阻断TRPC3通道：Control组，Vehicle组，Pyr3（1、5、10、20和30μmol/L）组，OGD/R组，OGD/R+Vehicle组，OGD/R+Pyr3（1、5、10、20和30μmol/L）组。
　　②siRNA干扰 TRPC3表达：Control组，OGD/R组，OGD/R+si-TRPC3组，OGD/R+si-Scramble组。
　　3.检测指标
　　①MTT法检测神经元的细胞存活率；
　　②LDH漏出率检测细胞膜完整性；
　　③Hochest33342染色检测神经元凋亡；
　　④激光共聚焦检测神经元的胞内钙离子浓度。结果
　　相较于OGD/R组，OGD/R+Pyr3组和OGD/R+si-TRPC3组神经元存活率明显降低，LDH漏出率增加，细胞凋亡率升高且具有剂量依赖性。阻断TRPC3通道可以降低OGD/R神经元胞内钙离子浓度。
　　结论：
　　特异性阻断TRPC3通道或下调TRPC3表达均可明显加重氧糖剥夺导致的神经元损伤，表明TRPC3通道可能在神经元OGD/R损伤中发挥了保护作用，这种保护作用可能和钙通道调节细胞内钙离子浓度，维持钙稳态有关。
　　第二部分 TRPC3通道对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用目的
　　采用新生大鼠HIBD模型，探讨TRPC3通道对缺氧缺血性损伤所致新生动物脑组织损伤的保护作用。
　　方法：
　　1.模型：新生7天SD大鼠，采用右侧颈总动脉结扎和缺氧（92%N2+8%O2）2 h制备HIBD模型。
　　2.分组
　　Sham组，Vehicle组，Pyr3（5、10、20和40mg/kg）组，HI组，HI+Vehicle组，HI+Pyr3（5和/或20mg/kg）组
　　3.检测指标
　　①脑组织含水量检测脑水肿；
　　②TTC染色检测脑梗死体积；
　　③HE染色观察脑组织病理损伤；
　　④神经行为学检测（神经功能缺损评分、平衡木实验和Morris水迷宫实验）；
　　⑤患/健侧脑重比；
　　⑥TUNEL染色检测神经元凋亡率；
　　⑦Western blotting检测蛋白表达。
　　结果：
　　与HI组相比，HI+Pyr3-20mg组急性期和长期神经行为学及脑组织损伤程度明显加重.神经功能缺损评分、平衡木实验和水迷宫实验结果显示Pyr3特异性阻断TRPC3导致HIBD动物的运动协调能力和空间学习记忆能力的缺损加重，脑组织水含量、TTC染色和患/健侧脑重比显示Pyr3可增加HI后的脑水肿和梗死体积，加重脑萎缩。TUNEL染色显示HI+Pyr3-20mg组神经元凋亡率较HI组增加。阻断TRPC3还可以显著抑制ERK1/2的磷酸化，并可上调促凋亡蛋白BAX和下调抗凋亡蛋白BCL-2的表达。
　　结论：
　　1.TRPC3通道参与新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用。
　　2.阻断TRPC3通道可以加重新生大鼠的缺氧缺血性脑损伤，其机制可能与其对细胞内钙离子浓度及ERK信号通路活性的调节作用有关。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 TRPC3通道对大鼠皮层神经元OGD/R损伤后的保护作用

1材料与方法

1.1实验材料

1.2主要试剂的配制

1.3实验方法

1.4统计学分析

2结果

2.1 TRPC3通道选择性阻断剂Pyr3对正常神经元的毒性作用的检测

2.2阻断TRPC3通道对OGD/R神经元的细胞存活率和LDH漏出率的影响

2.3阻断TRPC3通道对OGD/R神经元凋亡率的影响

2.4慢病毒包装的siRNA-TRPC3片段的筛选

2.5 siRNA干扰TRPC3通道表达对OGD/R神经元损伤的影响

2.6阻断TRPC3通道对OGD/R神经元细胞内钙离子浓度的影响

3讨论

第二部分 TRPC3通道对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

1材料与方法

1.1实验材料

1.2主要试剂的配制

1.3实验方法

1.4统计学分析

2结果

2.1检测Pyr3对正常新生大鼠脑组织的影响

2.2阻断TRPC3加重HI新生大鼠急性期脑损伤

2.3阻断TRPC3通道后恶化大鼠HIBD的长期转归

2.4阻断TRPC3通道加重缺氧缺血所致的神经元凋亡

2.5阻断TRPC3通道影响ERK信号通路蛋白质的表达

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:经典瞬时受体电位3通道功能的研究进展

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文