人脐带间充质干细胞联合尼达尼布治疗博来霉素所致小鼠肺纤维化及机制研究

摘要

第一部分人脐带间充质干细胞对博来霉素所致小鼠中晚期肺纤维化治疗作用 目的：观察单用人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）对博来霉素所致小鼠中晚期肺纤维化的治疗作用。 方法：成年C57BL/6小鼠随机分成4组，分别为：正常对照（Ctrl.）组，干细胞对照（MSCs）组，肺纤维化模型（B）组和干细胞治疗（B+MSCs）组。C57BL/6小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，通过气管插管向小鼠肺内滴注博来霉素3mg/kg建立肺纤维化模型，造模后第7天，干细胞对照组和干细胞治疗组经尾静脉注入hUC-MSCs（1×105/只）。造模后第21天处死小鼠，收集肺组织标本，进行肺组织切片H&E和Masson染色，Ashcroft评分，以及利用Sircol法检测肺内胶原含量。 结果：B+MSCs组较B组小鼠中位生存时间无明显差异；肺部病理改变亦无明显差异，两组小鼠均表现出大量炎性细胞浸润，肺间隔明显增厚，肺部结构紊乱甚至消失，大量胶原沉积的特征，Ashcroft评分两组小鼠间无差异；B+MSCs组和B组小鼠肺胶原含量均较正常对照组（Ctrl.）明显升高，但两组之间无明显差异。 结论：HUC-MSCs对博来霉素所致小鼠中晚期肺纤维化治疗效果不佳。 第二部分人脐带间充质干细胞联合尼达尼布改善博来霉素所致小鼠中晚期肺纤维化 目的：观察hUC-MSCs联合尼达尼布对博来霉素所致小鼠中晚期肺纤维化的治疗作用。 方法：成年C57BL/6小鼠随机分为5组，分别为肺纤维化模型（B）组，干细胞治疗（B+MSCs）组，干细胞联合低剂量尼达尼布（10mg/kg）治疗（B+MSCs+N10）组，单用低剂量尼达尼布治疗（B+N10）组和单用高剂量尼达尼布（30mg/kg）治疗（B+N30）组。腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，通过气管插管向小鼠肺内滴注博来霉素3mg/kg建立肺纤维化模型，造模后第7天，根据分组分别经尾静脉注入hUC-MSCs（1×105/只）和（或）行尼达尼布混悬液灌胃。造模后第21天处死小鼠，收集肺组织标本，进行肺组织切片H&E和Masson染色，Ashcroft评分，以及利用Sircol法检测肺内胶原含量。 结果：与B组小鼠相比，B+MSCs+N10组小鼠中位生存时间明显延长（P＜0.05），肺内炎性细胞聚集、肺间隔增厚和肺结构损害均改善，Ashcroft评分降低（P＜0.05），肺内胶原沉积明显减少（P＜0.05）。且hUC-MSCs联合10mg/kg尼达尼布对肺纤维化小鼠生存率、Ashcroft评分和肺内胶原沉积的改善与单用30mg/kg尼达尼布效果相当。 结论：HUC-MSCs联合尼达尼布能够改善博来霉素所致小鼠中晚期肺纤维化，且hUC-MSCs可减少尼达尼布用量。 第三部分尼达尼布抑制人脐带间充质干细胞分化为肌成纤维细胞 目的：探究尼达尼布对hUC-MSCs细胞的影响，寻找两者连用发挥抗纤维化作用的可能机制。 方法：通过RNA-Seq找出B+MSCs+N10组小鼠与B+MSCs组小鼠肺组织转录组差别，发现尼达尼布能够抑制血小板活化因子受体（Platelet activating factor receptor,Ptafr）的表达。体外培养hUC-MSCs，采用转化生长因子-β1（Transform growth factor-β1,TGF-β1）诱导其向肌成纤维细胞分化，通过Western blot及real-time PCR检测加用尼达尼布对TGF-β1诱导培养的hUC-MSCs细胞内纤维化相关标志物（结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）、α-平滑肌肌动蛋白（Alpha smooth muscle actin,α-SMA）、I型胶原α1（Collagen type I alpha1,COL1A1）和I型胶原α2（Collagen type I alpha2,COL1A2））表达、Ptafr含量及其下游丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine/threonine kinases,Akt）信号通路活性的影响。 结果：与B+MSCs组小鼠相比，B+MSCs+N10组小鼠肺组织转录组表达存在差异，差异倍数大于2倍且差异有统计学意义（P＜0.05）的基因含Ptafr在内共77个。GO分析结果显示，该群差异基因与细胞核酸代谢、基因表达调控、钙离子结合、GTP结合、粘多糖结合、多聚糖结合及细胞外基质代谢等多种细胞功能有关。 体外TGF-β1刺激hUC-MSCs细胞能够明显增加纤维化相关标志物表达，而尼达尼布能够抑制TGF-β1所致hUC-MSCs细胞内纤维化相关标志物增加，且可抑制TGF-β1所致hUC-MSCs中Ptafr的增加以及Ptafr下游MAPK和Akt信号通路的活化。 结论：尼达尼布能够阻止hUC-MSCs分化为肌成纤维细胞，该作用可能与其对Ptafr及其下游信号通路抑制有关。 第四部分人脐带间充质干细胞通过影响成纤维细胞特性而减少尼达尼布用量 目的：探索hUC-MSCs减少尼达尼布用量的可能细胞机制。 方法：超滤收集hUC-MSCs条件培养基，联合尼达尼布，培养人肺成纤维细胞HLF-9和WI-38，通过CCK-8观察不同处理组成纤维细胞的生长情况；通过BrdU细胞增殖试验观察不同处理组成纤维细胞的增殖情况。TGF-β1诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，Western blot检测不同处理组α-SMA的表达情况。胶原凝胶收缩试验检测不同处理组成纤维细胞胶原凝胶收缩能力。 结果：单用hUC-MSCs条件培养基不影响成纤维细胞HLF-9和WI-38细胞生长和增殖，但hUC-MSCs条件培养基与50nM尼达尼布联用可增强其对HLF-9和WI-38细胞生长和增殖的抑制。单用hUC-MSCs条件培养基对TGF-β1所致成纤维细胞胶原凝胶收缩能力增强无影响，但hUC-MSCs条件培养基与尼达尼布联用则可增强尼达尼布的抑制作用（P＜0.05）。TGF-β1可致成纤维细胞α-SMA表达增加，尼达尼布使α-SMA的增加减少约50%；而单用hUC-MSCs条件培养基则几乎可以完全抑制TGF-β1所致成纤维细胞α-SMA的增加（约90%），但该条件培养基对正常成纤维细胞内α-SMA的含量无明显影响。 结论：HUC-MSCs的条件培养基本身对成纤维细胞增殖及其对TGF-β1刺激的反应无明显影响；hUC-MSCs的条件培养基与尼达尼布联用，则可增强尼达尼布对成纤维细胞的抑制作用。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 人脐带间充质干细胞对博来霉素所致小鼠中晚期肺纤维化治疗效果不佳

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 人脐带间充质干细胞联合尼达尼布改善博来霉素所致中晚期小鼠肺纤维化

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三部分 尼达尼布抑制人脐带间充质干细胞分化为肌成纤维细胞

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四部分 人脐带间充质干细胞通过影响成纤维细胞特性而减少尼达尼布用量

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

文献综述：肺纤维化中间充质干细胞的作用

致谢

攻读博士期间研究成果及发表论文