TrkB调控PI3K/AKT途径促进喉癌转移机制的研究

摘要

背景： 喉癌（laryngeal cancer)为头颈部肿瘤中最为常见的恶性肿瘤之一，该病约占耳鼻咽喉部恶性肿瘤的7.9?35%，在所有类型头颈部恶性肿瘤中排名第三位，其发病率在全身所有类型恶性肿瘤中占5.7?7.6%。近年来，随着工业污染的加剧，喉癌的发病率呈逐年上升趋势，且其中大部分组织类型为鳞状细胞癌。目前引起喉癌发生的原因尚不十分清楚，大部分研究者认为与吸烟、饮酒、接触有害粉尘以及乳头状瘤病毒感染等有关。由于喉镜和影像学检查较难发现微小和隐匿性病变，因此对早期喉癌的诊断缺乏敏感性。随着现代医疗技术的飞速发展，喉癌在临床上的诊断和治疗取得了很大进步，但由于喉癌自身具有较为复杂的生物学行为，且临床表现多样，依然存在早期确诊率低、术后并发症多、复发率高等问题，所以寻找有效方法对喉癌进行早期诊断，同时采取行之有效的针对性喉癌治疗措施是目前医学研究者越来越重视的问题，也是喉癌治疗的重点和难点。喉癌的发生和恶性化进程为一个多因素参与、多基因和多条信号通路调控的复杂过程，且喉癌的扩散和转移与其原发部位、分化程度以及肿瘤大小等密切相关，但目前对于喉癌发生和发展的具体分子机制尚未完全探明。 酪氨酸激酶受体 B(tyrosine kinase receptor, TrkB)属于TRK编码的酪氨酸蛋白激酶家族成员，为脑源性神经生长因子（Bmin-derived Neurotrophic Factor, BDNF)的特异性受体，具有髙度的亲和力。近年来的研究发现，BDNF-TrkB还与多种恶性肿瘤的发生和发展有关，其中包括神经母细胞瘤、肝细胞癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌等，且与上述肿瘤的病例分级、临床分期、远处转移以及预后等病理情况相关。随着研究的不断深入，人们发现TrkB能够经由促进肿瘤细胞增殖、抗细胞凋亡、促进上皮间质化以及肿瘤血管新生等途径，对肿瘤细胞的生物学行为产生重要影响，在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用。 已发现磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)信号传导通路的异常改变往往出现在人类一些肿瘤组织中，且与该肿瘤的恶性化进程有关。作为一个较为多步骤并且较为复杂的过程，PI3K/AKT途径的完全活化能够在恶性肿瘤微环境中发挥作用，使得多种细胞因子在其作用下与相应的受体结合，在此过程中P I3 K得到活化。P-连环蛋白、Snail、NF-κB、GLTU4等多种细胞因子途径的提高使得活化的PI3K/AKT能够促进恶性肿瘤细胞的增殖生长、分化、侵袭以及转移等的发生。近年来的研究发现并证实了 PI3K/AKT通路在肺癌、结肠癌、卵巢癌以及子宫颈癌等多种人类恶性肿瘤中异常活化，且PI3K和AKT在包括胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌中的表达水平均异常上调。有关PI3K/AKT信号通路在喉癌的发生和发展过程中的研究依然较少。有研究发现，TrkB是PI3K/AKT信号通路介导的肿瘤转移和EM T程序的关键调节因子，TrkB能够通过影响PI3K/AKT信号通路相关基因的表达，进而促进卵巢癌细胞的侵袭和转移。 目的： 本研究检测TrkB在喉癌组织中的表达并分析其临床意义，同时通过体内外实验明确TrkB对喉癌细胞生物学行为和肿瘤生长的影响，并对其是否通过PI3K/AKT信号通路引起上述一系列过程进行探讨。旨在了解TrkB和PI3K/AKT信号通路在喉癌中的作用关系及相关机制，为喉癌的临床诊断和靶向治疗等提供可靠的实验依据和新的研究方向。 方法： (1)采集69例喉癌组织样本以及相应癌旁正常组织样本，采用荧光定量PCR检测上述组织中TrkB mRNA的表达，western blot法和免疫组化法检测TrkB蛋白的表达。分析TrkB与喉癌患者性别、年龄、吸烟史、临床分期、淋巴结转移、肿瘤部位的关系，同时分析喉癌患者无复发生存时间、总生存时间与临床病例参数的关系。 (2)采用荧光定量PCR法检测Hep-2、TU686、M4e细胞中TrkB mRNA的表达水平，从中选取TrkB mRNA表达水平最高的细胞系进行下一步实验。分别用0、100、500、600、1000 nmol/L TrkB抑制剂K252a作用于喉癌细胞，CCK-8法检测细胞的增殖活性，流式细胞术检测细胞的凋亡率和细胞周期，克隆形成实验检测细胞的集落形成能力，细胞划痕实验检测细胞的迁移能力，Transwell小室法检测细胞的侵袭能力。采用shTrkB沉默喉癌细胞中TrkB的表达，检测细胞的迁移能力。分别将K252a(500 nm ol/L)和SU6656(5μM)作用于喉癌细胞，检测细胞中p-AKT、cy c lin D l蛋白的表达。将SU6656(5μM)作用于喉癌细胞，检测细胞的克隆形成能力。将shTrkB转染喉癌细胞，检测细胞中p-c-Src、c-Src蛋白的表达。将喉癌细胞随机分为control组、shGFP组和shTrkB组，检测上述各组细胞中p-AKT、cyclinD1蛋白的表达。将shTrkB转染喉癌细胞，检测细胞中RUNX3和KEAP1 mRNA的表达。将K252a(500 nmol/L)作用于喉癌细胞，检测细胞中RUNX3和KEAP1 mRNA的表达。将PI3K抑制剂LY294002(25 nM)作用于喉癌细胞，检测细胞中RUNX3和KEAPlmRNA的表达。将shAkt转染喉癌细胞，检测细胞中RUNX3和KEAP1 mRNA的表达。将TrkB过表达质粒转染喉癌细胞，检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Twist-1、Twist-2蛋白的表达。 (3)将Hep-2细胞和Hep-2-shTrkB细胞接种于裸鼠皮下，建立喉癌细胞裸鼠移植瘤模型，观察小鼠成瘤情况。测量裸鼠移植瘤的长度(L)以及宽度（W)进行测量，计算移植瘤体积，于6周后将裸鼠处死并采集完整的移植瘤组织，称取重量。采用荧光定量PCR检测各组裸鼠移植瘤组织中TrkB、Twist-K Twist-2mRNA的表达。采集裸鼠移植瘤组织和正常喉黏膜上皮组织并制作病理切片，免疫组化染色后观察TrkB、cy c lin D1、AKT免疫染色情况，western blot法检测E-cadherin蛋白表达。 结果： (1)荧光定量PCR检测结果表明，与癌旁相应组织相比，喉癌组织中TrkB mRNA的表达水平明显增高（P＜0.05)。westernblot法检测结果表明，喉癌组织中TrkB蛋白的表达水平明显高于癌旁相应正常组织（P＜0.05)。免疫组化检测结果表明，TrkB免疫染色定位于细胞浆中，呈黄色或棕黄色颗粒。与癌旁相应组织相比，喉癌组织中TrkB蛋白的表达例数明显较多（P＜0.05)。TrkB与喉癌患者的性别、年龄、肿瘤部位无关，而与吸烟史、临床分期和淋巴结转移有关。喉癌患者无复发生存时间与性别、T分期无关，与年龄、N分期、M分期及TrkB表达相关；总体生存时间与性别、年龄、T分期、N分期无关，与M分期和TrkB表达相关；TrkB表达阳性的患者与TrkB表达阴性的患者在无复发生存时间和总体生存时间上存在明显差异。 (2) Hep-2细胞中TrkB m R N A的表达量明显高于TU686和M4e细胞，因此将Hep-2细胞作为后续实验所用细胞。随着K252a作用浓度的增大，各时间点Hep-2细胞的增殖活性逐渐降低，当K252a作用浓度为1000 nm ol/L时，Hep-2细胞的增殖活性最低，而相同浓度组细胞各时间点的增殖活性则无显著差异。随着K252a作用浓度的增加， Hep-2细胞的凋亡率随之增高，当K252a浓度为1000 nm ol/L时，Hep-2细胞的凋亡率最高。随着K252a作用浓度的增加，G2期细胞数量逐渐增多，G1期和S期细胞数量逐渐减少，提示TrkB表达抑制后能够使Hep-2细胞产生G2期停滞。随着K252a作用浓度的增加，Hep-2细胞克隆形成率逐渐降低，当K252a浓度为1000 nm ol/L时，Hep-2细胞的克隆形成率最低。随着K252a作用浓度的增加，Hep-2细胞迁移率逐渐降低，当K252a浓度为1000 nm ol/L时，Hep-2细胞的迁移率最低。与shGFP组相比，shTrkB组细胞的迁移能力明显降低（P＜0.05)。与control组相比，K252a和SU6656组细胞中p-AKT蛋白的表达水平均明显降低（P<0.01); K252a组细胞中cy c lin D l蛋白的表达水平明显降低 CP<0.01)，并且SU6656组细胞中cy c lin D1蛋白的表达水平也明显降低(P＞0.05)。与SU6656(-)组相比，SU6656(+)组细胞的克隆形成数明显减少（P<0.01)。与control组相比，shTrkB组细胞中p-c-Src蛋白的表达水平明显降低（P＜0.05)，而c-Src蛋白的表达量则无明显变化（P＞0.05)。shTrkB组细胞中p-AKT、cyclin D1蛋白的表达水平明显降低（P<0.01)。与control组相比，shTrkB组细胞中RUNX3和KEAP1 m R N A的表达水平均明显增高（P<0.01)。与K252a(-)组相比，K252a(+)组细胞中RUNX3和KEAP1 mRNA的表达水平均明显增髙（P<0.01)。与LY294002(-)组相比，LY294002(+)组细胞中RUNX3和KEAP1 mRNA的表达水平均明显增高（P＜0.05)。与control组相比，shAkt组细胞中RUNX3和KEAP1 mRNA的表达水平均明显增髙（P<0.01)。与control组相比，Overexpressed组细胞中 E-cadherin蛋白的表达水平明显降低（P＜0.05)，N-cadherin和Vimentin蛋白的表达水平则明显增高(P＜0.05)，Overexpressed组细胞中Twist-1和Twist-2蛋白的表达水平均明显增高（P＜0.05)。 (3)将Hep-2细胞和Hep-2-shTrkB细胞接种至裸鼠左前肢肩胛处近背部皮下后，于第8天时观察到裸鼠左前肢肩胛处近背部存在有黄豆大小的移植瘤，本实验所用的所有裸鼠都成瘤。对于裸鼠成瘤之后的生活状态进行观察，发现各组裸鼠在进食和饮水上均未出现异常，大小便亦正常。观察各组裸鼠的精神状态，均呈现良好状态，活动正常，反应迅速。除此之外，还对各组裸鼠的肤色进行观察并未发现异常、移植瘤组织也未发生破溃。与control组相比，shTrkB组裸鼠移植瘤体积和重量均明显减小（P＜0.05)。与control组相比，shTrkB组移植瘤组织中TrkB、Twist-1、Twist-2 mRNA的表达水平均明显降低(P＜0.05)。与control组相比，shTrkB组移植瘤组织中TrkB、cyclinDl、A K T免疫组化阳性染色也明显减少，E-cadherin蛋白表达明显增加(P〈0.05)。 结论： (1)T rkB在喉癌患者癌组织中的表达水平发生异常上调，且与喉癌患者的吸烟史、临床分期和淋巴结转移有关。 (2) TrkB能够促进喉癌细胞生长、侵袭和迁移，且抑制其凋亡;TrkB通过c-Src激活AKT，从而促进喉癌细胞增殖，同时通过上调EMT相关转录因子的表达，进而诱导EM T的发生。 (3) TrkB通过调控PI3K/AKT通路，促进EMT、侵袭、迁移相关基因的表达，进而促进喉癌的发生和发展。

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