RNA-Seq探索粪肠球菌利奈唑胺低水平耐药机制

摘要

目的：肠球菌是医院感染的重要病原菌，目前为止，肠球菌利奈唑胺已知的耐药机制主要包括23S rRNA的V区突变，L3、L4核糖体蛋白氨基酸突变以及甲基化转移酶基因cfr介导耐药。然而，以上机制不能解释低水平利奈唑胺耐药肠球菌（MIC:4-16 mg/L）机制。为完善低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌机制寻找新的耐药靶点，本研究首先对此类低水平耐药粪肠球菌采用Illumina HiSeq4000高通量转录组测序技术筛选出与耐药相关的基因及通路。随后对2014年至2017年重庆医科大学附属第一医院的利奈唑胺耐药粪肠球菌临床分离株的耐药机制及流行特征进行分析。 方法：1.本研究采用我院检验科分离的一株低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌（P10748 MIC:8mg/L）和一株利奈唑胺敏感粪肠球菌（3138 MIC:2 mg/L）进行Illumina HiSeq4000高通量转录组测序及生物信息学分析，标准菌株ATCC29212作为质量评估。利用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行注释与富集分析，并利用荧光定量PCR对测序中的差异表达基因进行验证。 2.我们收集了2014年到2017年我院检验科微生物室共1120株粪肠球菌，根据美国CLSI标准筛选出43株利奈唑胺耐药粪肠球菌菌株（MIC≥8 mg/L）。采用微量肉汤稀释法测定利奈唑胺对以上菌株的最低抑菌浓度（MIC），应用基因测序技术检测其可能存在的耐药机制包括23S rRNA的V区、核糖体蛋白L3和L4、optrA基因以及cfr基因，并与标准菌株ATCC29212及人源粪肠球菌E349菌株进行核苷酸序列相似性比对，分析基因突变与耐药的相关性。利用多位点序列分型（MLST）探究利奈唑胺耐药粪肠球菌间的同源性及分子流行特点。 结果：1.测序共获得了3.57 Gb有效数据，通过De novo拼接获得1,920条unigenes，总长度为2,122,210 bp，平均长度为1,105 bp。差异基因模式聚类分析显示共有150个显著性差异表达基因（FDR≤0.001,|log2 Ratio|≥1），其中141个上调，9个下调。生物膜形成和外排泵相关基因esp、optrA、fexA在耐药菌中显著上调。GO功能注释结果显示，催化活性、代谢过程和细胞是注释最多的条目；Pathway富集分析发现，肽聚糖生物合成、缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸的降解和硫代谢为显著性富集通路（p＜0.05）。荧光定量 PCR对差异表达基因的验证结果与测序结果的趋势基本一致。 2.利用微量肉汤稀释法对43株粪肠球菌的利奈唑胺药敏检测显示MIC范围在8-16mg/L，其中32株（MIC:16 mg/L）剩余11株（MIC:8mg/L）。43株利奈唑胺耐药粪肠球菌株均未发现23S rRNA V区突变，也未检出 cfr基因，所有菌株均检测出 optrA基因。与粪肠球菌 E349的OptrA蛋白相比，我们发现8株粪肠球菌在Glu60Lys和Gly197Asp位置有新的氨基酸取代。有4株粪肠球菌的核糖体蛋白L3检测出一个新的突变位点Ser113Leu；有31株核糖体蛋白L4检测出一个新的缺失和三个新的点突变，包括Thr35Ala，Ile98Val，Asn79Asp替换和Gln103缺失，但并未发现突变与MIC的直接关系。 3.采用多位点序列分型（MLST）分型显示，43株利奈唑胺耐药粪肠球菌被分为20个ST型，其中以ST16为主有14株；ST69有4株；ST632有3株；ST480有3株。其中有9株我们发现了新的ST型ST823至ST830，同时也发现了新的等位基因gki95。未出现克隆复合体，分离株之间没有克隆相关性。 结论：1.推测膜转运蛋白OptrA和与生物膜形成相关的肠球菌表面蛋白 Esp可能在耐药机制中发挥重要作用，这为低水平利奈唑胺耐药肠球菌机制提供了可参考的耐药靶标。 2.optrA基因在耐利奈唑胺粪肠球菌呈现出高携带率，它在低水平利奈唑胺耐药机制中具有重要作用，其可能是低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌的良好预测标志物。 3.我院2014-2017年分离的低水平利奈唑胺耐药肠球菌的感染病例呈现散发性而不是暴发性。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌转录组测序及生物信息学分析

1材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 临床分离低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌的耐药机制研究及分子流行病学特征

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述:肠球菌利奈唑胺耐药机制研究现状及进展

致谢

硕士期间发表的论文