LytR蛋白参与肺炎链球菌荚膜多糖和磷壁酸的表面锚定作用研究

摘要

目的： 肺炎链球菌的荚膜多糖（Capsule,CPS）是肺炎链球菌重要的毒力因子，而磷壁酸(teichoic acid,TAs)是革兰阳性菌细胞壁上特有的成分并且维持细胞形态，两者都在细菌的粘附、侵袭的过程中发挥了重要作用，但它们锚定到细胞壁的合成过程尚不清楚。LytR蛋白（SPD_1741）属于LytR-Cps-Psr（LCP）家族成员，LCP蛋白家族在多种细菌中被证明参与细胞壁多糖锚定在肽聚糖上的过程，但尚不清楚LytR（SPD_1741）蛋白是否参与肺炎链球菌细胞壁多糖的表面锚定过程。本研究初步探索了LytR蛋白（SPD_1741）在细菌荚膜多糖和磷壁酸表面锚定中的作用，并进一步观察了其对细菌表型和毒力的影响，为了解肺炎链球菌荚膜和磷壁酸生物合成的分子机制提供新的实验证据，并为抗肺炎链球菌感染的治疗提供新的作用靶点。 方法： 采用Western blot技术分析LytR蛋白的表达时相；通过流式细胞术（FACS）测定野生菌表面的LytR蛋白含量并确定LytR蛋白的位置；采用长臂同源重组技术构建ΔlytR缺陷菌，采用质粒pJWV25构建lytR异位回补菌；体外培养野生菌、ΔlytR缺陷菌、lytR异位回补菌和外源性添加LytR蛋白的缺陷菌，绘制生长曲线以观察细菌的繁殖能力，并利用透射电镜观察细菌的细胞壁及荚膜的变化；利用Western blot，ELISA和Dot blot等技术检测野生菌、ΔlytR缺陷菌、lytR异位回补菌和外源性添加LytR蛋白的缺陷菌磷壁酸和荚膜多糖变化；通过细胞粘附实验，抗巨噬细胞吞噬能力实验，鼻腔攻毒实验分析细菌的毒力差异；采用EMSA实验分析LytR蛋白与lytA、cps、rafX操纵子启动子结合情况。 结果： LytR蛋白在野生菌的不同生长时期的表达量较高且无显著差异。FACS结果显示LytR蛋白可表达于细菌的表面；相比D39野生菌，D39ΔlytR缺陷菌表现出生长迟缓、平台期变短、自溶提前、细胞壁不完整、磷壁酸含量减少、荚膜残缺的现象。D39lytR异位回补菌及外源性添加蛋白的D39ΔlytR缺陷菌，其生长均得到恢复，荚膜和细胞壁与 D39野生菌则无显著差异。相比D39野生菌、D39lytR异位回补菌、外源性添加蛋白的D39ΔlytR缺陷菌，D39ΔlytR缺陷菌全菌的荚膜多糖和磷壁酸的含量明显减少(p<0.05)，而在其培养上清中的含量却明显增加(p<0.05)。体外粘附实验显示R6ΔlytR缺陷菌相比野生菌的粘附能力显著下降(p<0.05)。体外抗吞噬实验显示巨噬细胞对D39ΔlytR缺陷菌较野生菌粘附的能力显著减弱(p<0.05)。小鼠感染D39野生菌死亡率达到83.3%，而感染D39ΔlytR缺陷菌死亡率为0%，二者有显著差异(p<0.05)。感染D39野生菌的小鼠肺组织出现了大量的炎症细胞浸润、充血、肺间质增生等变化，而感染D39ΔlytR缺陷菌小鼠的肺部炎症反应较轻。EMSA结果显示LytR蛋白并未与lytA、cps、rafX操纵子启动子特异结合。 结论： LytR蛋白在肺炎链球菌中稳定表达，可能参与荚膜多糖、磷壁酸在细胞壁表面的锚定过程，并影响到细菌的形态、生长、自溶和毒力。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1实验材料

1.1菌株和质粒

1.2引物

1.3实验动物

1.4实验试剂

1.5主要仪器

2.实验方法

2.1 lytR基因缺陷菌株构建

2.2异位回补表达pJWV25-spd_1741质粒构建

2.3 SPD_1741蛋白在E.coli BL21中表达纯化

2.4生长曲线

2.5细菌形态学变化

2.6磷壁酸的改变

2.7荚膜多糖的变化

2.8流式细胞术（FACS）分析

2.9小鼠毒力实验

2.10定植实验

2.11肺组织病理切片及染色

2.12细胞粘附侵袭实验

2.13细胞抗吞噬实验

2.14电泳迁移率试验（EMSA）

2.15统计方法

3实验结果

3.1构建并验证ΔlytR缺陷菌

3.2构建并验证ΔlytR mutant-complement回补菌

3.3 LytR重组蛋白的诱导表达及纯化

3.4肺炎链球菌不同生长时期LytR蛋白表达情况分析

3.5细菌表面的LytR蛋白分析

3.6 LytR蛋白对于细菌生长而言是至关重要

3.7电子显微镜下的细菌的形态学变化

3.8 LytR参与了荚膜多糖的表面锚定过程

3.9 LytR参与了磷壁酸合成的过程

3.10 LytR蛋白影响细菌的粘附能力

3.11 LytR蛋白影响细菌的抗吞噬能力

3.12缺陷lytR使细菌毒力减弱

3.13缺陷lytR使细菌定植和侵袭力减弱

3.14 EMSA验证LytR蛋白与LytA/CPS/RafX启动子片段的未结合

4讨论

全文总结

参考文献

文献综述:LytR-CpsA-Psr蛋白家族的研究现状

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文题录