运用CRISPR/Cas9构建CXCR4基因编辑慢病毒载体

摘要

目的：以 CXCR4为靶基因，采用 CRISPR/Cas9技术构建可诱导表达基因编辑慢病毒载体系统,并且在MKN-45细胞系验证其基因编辑功能。 方法：分别以 lenti-cas9-BLAST和 PX458质粒为模板，扩增Blasticidin s及T2A-GFP基因片段，凝胶电泳回收后与Lenti-guide-puro质粒重组，获得重组质粒Lenti-guide-BLAST-GFP。针对CXCR4基因EXON2设计并合成三条sgRNA，与Lenti-guide-BLAST-GFP重组获得Lenti-guide-BLAST-GFP-sgRNA质粒，扩增后进行慢病毒载体包装。对pCW-Cas9质粒扩增后进行慢病毒包装。然后将上述两种载体依次感染MKN45细胞，压力筛选培养，经DOX1μg/ml诱导后，检测MKN-45细胞CXCR4蛋白表达和基因突变水平，并验证CXCR4基因编辑前后MKN-45细胞对SDF-1应答改变。 结果：经过测序证实，成功构建了 Lenti-guide-BLAST-GFP和Lenti-guide-BLAST-GFP-sgRNA质粒，并成功获得Lenti-guide-BLAST-GFP和Lenti-guide-BLAST-GFP-sgRNA两种慢病毒载体。MKN-45细胞经过上述慢病毒载体感染及筛选后，经DOX诱导，T7E1实验证实gRNA-1，gRNA-2以及gRNA-3对CXCR4基因编辑效率分别为45.6%，53.6%，and56.7%。Western blotting实验证实CXCR4蛋白表达明显减低；transwell迁移实验证实，MNK-45细胞对SDF-1应答能力减弱，与空白对照平均每高倍镜视野（400×）36.13±2.00个细胞相比，三条gRNA编辑后细胞，迁移至下室细胞分别为30.03±0.23，29.73±1.55,28.20±1.11(P＜0.05)。 结论：本研究成功构建了以 CXCR4为靶基因，可诱导表达CRISPR/Cas9的慢病毒双载体基因编辑系统。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1.1试剂说明

1.2试剂配制

1.3仪器说明

2实验方法

2.1细胞培养与冻存

2.2慢病毒双载体构建与包装

2.3慢病毒功能验证

2.4统计学分析

3实验结果

3.1重组真核表达质粒Lenti-guide-BLAST-GFP构建成功

3.2重组真核表达质粒Lenti-guide-BLAST-GFP-sgRNA构建成功

3.3包装慢病毒成功对CXCR4基因进行编辑

3.4 CRISPR/Cas9系统编辑CXCR4基因后细胞迁移功能改变

4讨论

全文总结

参考文献

文献综述:CXCR4基因功能研究进展

致谢

硕士期间发表论文