骨髓间充质干细胞内源性白细胞介素-6抑制缺氧缺血性脑损伤海马神经元自噬及机制初探

摘要

第一部分骨髓间充质干细胞抑制缺氧缺血性脑损伤海马神经元自噬的作用 目的： 探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）对新生缺氧缺血性脑损伤（HIBD）大鼠海马神经元的自噬作用。 方法： 选取新生7d龄SD仔鼠，经左侧颈总动脉结扎并缺氧2.5h构建HIBD损伤模型，于损伤0h、12h、24h、48h、72h、5d和7d收集海马组织。将HIBD大鼠经侧脑室注射5?l含2?105 MSCs的细胞悬液，为HIBD+MSCs组；以注射等体积灭菌PBS为其对照组（HIBD组）；于MSCs移植后12h、24h收集海马组织，于MSCs移植后4w行Morris水迷宫测试大鼠学习记忆功能。体外将原代培养5d的胎鼠海马神经元经OGD损伤，于损伤0h、6h、12h、24h、48h、72h收集OGD损伤的神经元细胞。构建OGD损伤的海马神经元与MSCs分离共培养模型，同时以单独OGD损伤及未损伤的神经元为对照组，于共培养12h、24h后收集OGD损伤神经元。Western blotting检测MSCs移植后HIBD大鼠海马及共培养后的OGD损伤神经元中不同时间点自噬相关蛋白-Beclin1、LC3 II、p62表达水平变化，透射电镜观察MSCs共培养后的OGD损伤神经元中自噬小体数量。 结果： （1）Western blotting检测显示HIBD损伤12-24h后的大鼠海马组织自噬相关蛋白Beclin1及LC3 II表达水平较其他时间点均明显上调(P＜0.001），MSCs的移植显著抑制了损伤海马中上调的Beclin1、LC3 II蛋白水平，并明显增加p62蛋白的表达(P＜0.001）。 （2）Morris水迷宫训练结果显示，MSCs移植组大鼠较HIBD组在训练2-5d内找到平台的时间显著缩短，第6d穿越平台区域次数也较HIBD组显著增多(P＜0.01）。 （3）OGD损伤12h也可诱导原代海马神经元Beclin1、LC3 II蛋白表达水平上调(P＜0.001），而MSCs分离共培养后却显著降低OGD损伤神经元中Beclin1、LC3 II蛋白表达水平，上调p62表达水平(P＜0.001）。 （4）透射电镜观察显示，MSCs分离共培养可显著减少OGD损伤海马神经元中自噬小体的数量(P＜0.001）。 结论： 无论HIBD损伤还是体外OGD损伤均可在损伤急性期引起海马组织神经元的自噬发生，而MSCs移植或分离共培养可显著下调HIBD大鼠海马组织或OGD损伤海马神经元中自噬相关蛋白Beclin1、LC3 II表达水平，增加p62蛋白表达，减少OGD损伤急性期神经元自噬小体数量，促进HIBD大鼠学习记忆功能的修复。 第二部分抑制骨髓间充质干细胞内源性白细胞介素-6上调缺氧缺血性脑损伤海马神经元中的自噬水平 目的： 探讨MSCs内源性IL-6对HIBD新生大鼠海马组织自噬的影响及其可能分子机制。 方法： 将HIBD新生SD大鼠行侧脑室注射5?l含2x105 siIL-6 MSCs或GFP MSCs的细胞悬液，分别于移植后12h、24h收集HIBD大鼠海马组织。体外OGD损伤的原代海马神经元分别与siIL-6 MSCs或GFP MSCs进行分离共培养，于共培养后12h、24h收集OGD神经元。Western blotting检测移植后HIBD大鼠海马组织及共培养后的OGD损伤海马神经元中Beclin1、LC3 II、p62、IL-6、p-AMPK及p-mTOR蛋白表达水平变化，透射电镜观察共培养后的OGD损伤神经元中自噬小体数量。 结果： （1）Western blotting检测发现siIL-6 MSCs移植12h、24h后HIBD大鼠海马组织中Beclin1和LC3 II的蛋白表达水平显著升高(P＜0.001），但p62的表达水平却明显降低(P＜0.001）。siIL-6 MSCs分离共培养后OGD损伤海马神经元中的Beclin1、LC3 II和p62蛋白水平与体内检测结果一致(P＜0.001）。 （2）siIL-6 MSCs移植后的HIBD大鼠海马组织及共培养后的OGD损伤神经元中的IL-6、磷酸化mTOR（p-mTOR）的蛋白表达水平均显著低于GFP MSCs对照组(P<0.001)；而磷酸化的AMPK（p-AMPK）蛋白表达水平较对照组却有明显升高（P<0.001）。 （3）扫描电镜观察发现与siIL-6 MSCs分离共培养12h、24h后OGD损伤神经元中自噬小体数量较GFP MSCs对照组明显增多(P<0.001)。 结论： 上述体内外的研究结果表明，抑制MSCs中IL-6分泌水平，不仅可显著上调HIBD大鼠海马组织及OGD损伤海马神经元中自噬相关蛋白Beclin1、LC3 II表达水平，抑制p62蛋白表达，而且可激活损伤神经元中的p-AMPK活性，抑制p-mTOR通路，增加OGD损伤急性期神经元中自噬小体数量。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 骨髓间充质干细胞对缺氧缺血性脑损伤海马组织自噬的作用

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分 骨髓间充质干细胞内源性白细胞介素-6对缺氧缺血性脑损伤海马组织中自噬的调节作用

1材料与方法

2结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述:自噬在脑缺血性损伤中的作用

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章及参加的学术交流