题目一：APP/PS1/LC3三转基因小鼠的构建及其自噬流动态变化研究；题目二：雷帕霉素对阿尔茨海默病的保护作用及其机制初探

摘要

第一部分 APP/PS1/LC3三转基因小鼠的构建及其自噬流动态变化研究 目的： 构建APP/PS1/LC3三转基因小鼠并观察自噬流在阿尔茨海默病中的动态变化。 方法： 将CAG-mRFP-eGFP-LC3转基因自噬流模型小鼠与APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)模型小鼠交配繁殖，对产下的子代进行基因分型鉴定，选出同时含有CAG-mRFP-eGFP-LC3基因和APP/PS1的小鼠为APP/PS1/LC3三转基因小鼠，Morris水迷宫实验检测小鼠行为学变化，透射电镜下观察自噬体的形成，采用免疫组织化学法检测老年斑的形成。取3月龄、6月龄、10月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠和同窝同月龄CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠各6只，断头取脑后在荧光显微镜下观察自噬流的变化，用Western blot检测自噬标志物。 结果： 基因分型证实APP/PS1/LC3三转基因小鼠构建成功。Morris水迷宫显示，APP/PS1/LC3三转基因小鼠找到平台的平均潜伏期和路程均明显增加，穿越平台的次数明显减少。透射电镜下观察，6月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠脑神经元内出现更多的自噬小泡。免疫组化染色结果显示3月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠脑内未见老年斑，6月龄和10月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠大脑皮质及海马区域出现明显老年斑，而同窝各年龄段CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠脑内均未见老年斑。Western blot结果显示：与同窝CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠比较，APP/PS1/LC3三转基因小鼠脑内APP蛋白明显升高。荧光显微镜下观察，与同窝3月龄CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠比较，3月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠海马区自噬体数量明显增多，但自噬溶酶体数量未见统计学差异，大脑皮质内自噬体与自噬溶酶体数量均未见差异。与同窝6月龄CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠比较，6月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠海马区自噬体及自噬溶酶体数量均明显增高，大脑皮质内自噬体数量亦明显升高，但自噬溶酶体数量与同月龄CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠相比，其差异未见统计学意义。10月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠与同月龄CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠相比，海马区自噬体及自噬溶酶体数量均明显增高，大脑皮质区自噬体及自噬溶酶体数量亦见明显上升。Western blot结果表明，3月龄、6月龄、10月龄自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62水平均增高，3月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠溶酶体膜蛋白LAMP1表达水平与同窝CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠相比未见统计学差异，但6月龄、10月龄溶酶体膜蛋白LAMP1表达水平降低。 结论： 3月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠自噬被激活，自噬溶酶体降解障碍受阻，但尚未出现溶酶体功能缺陷，表明自噬在AD的早期已有功能缺陷。6月龄、10月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠自噬仍处于被激活状态，但出现自噬溶酶体降解持续受阻和溶酶体功能障碍，表明自噬在 AD病程的中晚期已严重功能失调，可能是加重AD病理进程的原因之一。APP/PS1/LC3三转基因小鼠具有 AD模型小鼠的进行性认知功能障碍和病理损害，且能直观、动态地反映自噬进程，是研究AD自噬流水平的理想动物模型。 第二部分雷帕霉素对阿尔茨海默病的保护作用及其机制初探 目的： 研究雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）对阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的保护作用，并探讨其发挥作用的潜在机制。 方法： 在动物实验中，取4月龄的雄性APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠共10只，随机分为Rapa治疗组和对照组，共2组，每组实验小鼠5只。治疗组小鼠按2 mg/(kg·d)用量经灌胃给药Rapa，对照组小鼠灌胃等量经生理盐水稀释的DMSO溶液。用药4周后，通过高架十字迷宫、旷场试验、新物体识别试验、巴恩斯迷宫检测雷帕霉素对阿尔茨海默病的的空间记忆能力及认知功能的影响。运用免疫荧光和甲硫素染色的方法评估Rapa对老年斑的影响，Western blot法研究Rapa对β-淀粉样蛋白（Amyloid-β，Aβ）和Tau蛋白产生的影响。从蛋白水平评估Rapa对自噬活动的影响。通过Western blot检测 Rapa对Wnt/GSK-3β/β-Catenin信号通路的影响。在体外实验中，以50nM和100nM浓度的Rapa作用于过度表达APPsw的SH-SY5Y细胞,用EdU检测法和Western blot法观察Rapa对神经元增殖的影响。对过度表达APPsw的SH-SY5Y细胞转染自噬mRFP-GFP-LC3双标腺病毒后给予Rapa处理，荧光显微镜下观察自噬活动的变化。 结果： 在动物实验中，雷帕霉素对APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠的空间记忆及认知功能无明显影响。雷帕霉素能够减少AD小鼠脑内老年斑的数量和面积，减少Aβ的表达，降低β-分泌酶（BACE1）、γ-分泌酶（PS1）的水平，增加胰岛素降解酶（insulin-degrading enzyme，IDE）的表达，但淀粉样蛋白前体（Amyloid-βprotein precursor,APP）未见改变。雷帕霉素能够减少AD小鼠脑内的 Tau蛋白，并减少其磷酸化。雷帕霉素治疗后，自噬蛋白LC3II/I,Beclin1在AD小鼠脑内表达水平升高，溶酶体降解底物 P62表达降低，表明自噬受激活，降解作用增强。与对照组相比，Wnt/GSK-3β/β-Catenin信号通路在雷帕霉素治疗后被激活，Wnt3a、β-Catenin表达增多，而GSK-3β水平减少，Ser9位点磷酸化的GSK-3β是其低活性的形式，在雷帕霉素治疗后表达升高。雷帕霉素还能增加新生神经元标记蛋白NeuN的表达。在体外实验中，50nM和100nM的雷帕霉素均能刺激神经元的增殖。自噬双荧光指示体系也表明50nM和100nM的雷帕霉素均能够激活自噬。 结论： 雷帕霉素能够通过诱导自噬和激活Wnt/GSK-3β/β-Catenin信号通路，减少AD小鼠脑内老年斑的沉积，减少Aβ的生成，增加Aβ的清除，减少Tau蛋白的聚集，从而对AD发挥保护作用。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

第一部分 APP/PS1/LC3三转基因小鼠的构建及其自噬流动态变化研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4全文小结

参考文献

第二部分 雷帕霉素对阿尔茨海默病的保护作用及其机制初探

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4全文小结

参考文献

文献综述:阿尔茨海默病与自噬、GSK-3β的相关性研究进展

致谢

攻读硕士期间发表的论文