钆掺杂荧光二氧化硅靶向前列腺癌双模态成像的实验研究

摘要

第一部分钆掺杂荧光二氧化硅纳米探针的制备及基本性质检测 目的:通过优化反应条件，制备钆掺杂荧光二氧化硅靶向双模态纳米探针(Gd@Cy5.5@SiO2-Ab)，并对其基本性质进行检测。 方法:以 TX-100、环己烷、正己醇、钆喷酸溶液为微乳液体系， TEOS、Cy5.5-APTES为硅源及前驱体，氨水作为催化剂，采用反相微乳液法，制备了含钆量不同的荧光二氧化硅纳米探针。序贯对上述合成的二氧化硅纳米粒子（NPs）表面进行氨基、羧基修饰，再通过碳二亚胺法与抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）的单克隆抗体（YPSMA-1， mAb）结合，制备靶向前列腺癌的纳米探针 Gd@Cy5.5@SiO2-Ab，并对其表面形态、粒径、电位、化学结构等进行检测；采用电感耦合原子发射光谱仪（ICP-AES)检测纳米探针中钆含量及钆稳定性；荧光光谱仪对纳米探针的荧光信号进行分析；免疫荧光法检测YPSMA-1抗体是否成功连于二氧化硅表面。 结果:透射电镜(TEM)观察示所制备纳米探针呈表面光滑、形态规则的球形形貌，分散性好，大小较均匀。Zeta电位及傅里叶红外光谱显示氨基及羧基基团成功修饰于二氧化硅表面。ICP-AES结果表明：添加钆喷酸溶液的量不同，所制备的靶向纳米探针Gd@Cy5.5@SiO2-Ab中钆含量最高为8.21±0.63％；并且钆离子（Gd3+）在其中的稳定性高，不易泄漏。MR成像显示靶向纳米探针的纵向弛豫率(r1)为13.234mM-1s-1。紫外光谱结果提示荧光染料Cy5.5成功掺杂入二氧化硅纳米粒子。荧光光谱结果表明靶向纳米探针的荧光发射峰形态与自然状态 Cy5.5的荧光发射峰形态无明显差别。免疫荧光法检测YPSMA-1抗体成功连于二氧化硅表面。 结论:通过添加反应物的不同剂量，确定了最佳反应剂量。纳米探针表面通过化学方法成功引入氨基及羧基基团，再经抗体修饰可制备靶向探针。体外MR成像结果表明制备的纳米探针具有较高的弛豫率；荧光光谱检测显示探针的荧光发射峰形态较自然状态无明显差别，有利于MRI/荧光成像。 第二部分钆掺杂荧光二氧化硅纳米探针体外寻靶、细胞毒性及体外成像实验 目的:观察纳米探针体外细胞靶向性，并对其细胞毒性进行检测；研究体外细胞成像的效果，探讨其作为体内显像剂的可行性。 方法:体外培养高表达PSMA的前列腺癌细胞株LNCaP与低表达PSMA细胞株PC3，并设置非靶向探针组(Gd@Cy5.5@SiO2)进行对照，观察靶向探针(Gd@Cy5.5@SiO2-Ab)与上述两种细胞的结合能力。CCK8法检测所制备探针对细胞活性的影响，并设置多组不同浓度对照，对各种探针的细胞毒性进行探讨。体外培养细胞株LNCaP与PC3，并与靶向探针共孵育后，行体外MRI/荧光成像，观察靶向探针体外成像效果。 结果:体外细胞寻靶实验显示：前列腺癌细胞株LNCaP+靶向探针组细胞膜周围可见较多靶向探针分布（呈红色荧光），而PC3+靶向探针组细胞膜周围未见明显红色荧光；非靶向组细胞膜周围亦未见明显红色荧光。流式细胞术提示：靶向纳米探针组与LNCaP及PC3细胞的结合率分别99.79%和2.34%，非靶向探针与LNCaP及PC3细胞的结合率分别为4.58%、2.74%。CCK8法结果表明：制备的各种纳米探针在测试的浓度及时间范围内对细胞活性影响不大，具有良好的安全性。体外MRI/荧光成像结果表明：LNCaP细胞与所制备的靶向纳米探针共孵育后在 T1WI上呈高信号，而 PC3细胞则呈低信号。荧光成像结果显示 LNCaP+靶向纳米探针组可见明显红色荧光，PC3+靶向纳米探针组未见明显红色荧光。 结论:所制备的纳米探针表面经抗体修饰后而具有靶向性，在体外对PSMA受体高表达的LNCaP细胞有良好的靶向能力；纳米探针在测试的浓度及时间范围内对LNCaP及PC3细胞活性无明显影响，表明具有良好的安全性；并且体外 LNCaP细胞与靶向纳米探针共孵育后于T1WI图像上呈高信号，荧光成像呈明显红色荧光，提示靶向纳米探针能体外成像，为体内实验奠定基础。 第三部分钆掺杂荧光二氧化硅纳米探针体内成像、生物安全性及分布实验 目的:观察靶向纳米探针体内双模态成像效果；探讨其在裸鼠各脏器内的分布情况及生物安全性。 方法:选取 LNCaP、PC3移植瘤裸鼠各10只，进行小动物活体MR成像。经尾静脉缓慢注射靶向纳米探针 Gd@Cy5.5@SiO2-Ab及Gd-DTPA（Gd浓度为0.01mM/kg），于不同的时间点（注射前、注射后15min、1h、3h、6h和24h）采集MR图像，并对其信号强度进行分析。注射靶向纳米探针Gd@Cy5.5@SiO2-Ab后采集肝、脾、肾、肌肉等部位MR图像，分析其体内分布情况。选取LNCaP、PC3移植瘤裸鼠各5只，进行小动物活体荧光成像，经尾静脉缓慢注射Gd@Cy5.5@SiO2-Ab探针，每只注射用量为0.2ml（10mg/ml）。于不同的时间点采集活体荧光图像，并对其荧光信号强度进行分析。经尾静脉注射靶向纳米探针1d及3d后，收集血液样品行生化分析，并解剖裸鼠取出主要器官（心、肝、脾、肺、肾），送病理科做病理切片及HE染色。 结果:LNCaP移植瘤裸鼠模型体内MR成像的研究结果表明，经尾静脉注射靶向探针后，肿瘤组织信号强度逐渐增强，于注射后3h达到峰值；PC3移植瘤裸鼠模型体内 MR成像结果显示，经尾静脉注射靶向探针后，肿瘤组织信号强度于1h后出现轻微增强，LNCaP组较PC3组肿瘤信号增强更为明显，p＜0.05，差异具有统计学意义。小动物活体荧光成像结果显示PC3组肿瘤内部几乎观察不到荧光；而LNCaP组在肿瘤内部聚集发出明显红色荧光。Living image软件系统分析荧光强度见 LNCaP组荧光强度明显高于 PC3组，p＜0.05，差异具有统计学意义。纳米探针体内分布实验显示注射纳米探针后肝、脾、肾T1信号增高，肝、脾、肾信噪比高于注射前，提示纳米探针一部分被肝脾吞噬，经肠道排泄；一部分经肾脏由尿液排泄。心、肝、脾、肺、肾组织HE染色病理切片未见明显坏死及炎性反应；生化检测指标（天冬氨酸转氨酶（AST），丙氨酸转氨酶（ALT），总胆红素（T-BIL），血尿素氮（BUN）和肌酐（CREA））在注射前后无明显变化(P＞0.05)，表明合成的纳米探针体内生物安全性好。 结论:靶向纳米探针 Gd@Cy5.5@SiO2-Ab在体内能够增强磁共振及荧光成像，可靶向聚集于肿瘤组织内，具有增强磁共振及荧光双模态成像的能力，体内生物安全性好，为前列腺癌的诊断提供了新的思路。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 钆掺杂荧光二氧化硅纳米探针的制备及基本性质检测

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

附图

第二部分 钆掺杂荧光二氧化硅纳米探针体外寻靶、细胞毒性及体外成像实验

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

附图

第三部分 钆掺杂荧光二氧化硅纳米探针体内成像、生物安全性及分布实验

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

附图

全文总结

文献综述:磁共振/光学双模态分子探针的研究现状

致谢

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