糖基化终末产物启动糖尿病肾病肾纤维化进程的机制研究

摘要

目的：糖尿病肾病(diabetic kidneydisease, DKD)是糖尿病的常见并发症之一，可发生肾小管上皮细胞间充质转分化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)，最终发展为肾纤维化。肾小管上皮细胞EMT在肾脏纤维化进程中具有关键性作用，被认为是肾纤维化进程启动的标志。多种因素可以导致糖尿病肾病肾纤维化的发生，如糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGES)、线粒体功能紊乱、自噬功能紊乱、炎症通路的激活等，但具体机制仍不清楚。人白细胞分化抗原36（Cluster of Differentiation36，CD36）是一种跨膜糖蛋白分子，在长链脂肪酸的跨膜转运及代谢性炎症的发生中起着重要作用。研究发现，CD36可介导多种原因导致的肾脏损伤，加速肾脏疾病的进展。CD36的生物学功能主要受其翻译后棕榈酰化修饰调节。本课题旨在研究糖基化终末产物是否能通过调节CD36棕榈酰化，影响肾小管上皮细胞间充质转分化，从而启动糖尿病肾病肾纤维化进程，并且探讨其可能的分子机制。 方法：第一部分：采用10只C57BL/6J背景的野生型小鼠为动物模型，随机分为正常对照组（CON组）、糖尿病肾病组（DKD组），每组5只。采用腹腔多次小剂量注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）构建小鼠糖尿病肾病动物模型。糖尿病肾病动物模型构建成功后，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清及肾组织中的糖基化终末产物羧甲基赖氨酸（Nε-(carboxymethyl)-lysine, CML）水平；检测小鼠血清随机血糖、白蛋白、肌酐、尿素氮水平。代谢笼收集小鼠24小时尿液，并检测小鼠尿蛋白；苏木精-伊红（Haematoxylin-eosin, HE）染色了解肾组织基质增生情况；天狼猩红染色了解肾组织胶原蛋白沉积情况；免疫组织化学法检测肾组织EMT相关指标（α-平滑肌动蛋白，α-SMA、E-钙粘蛋白，E-cadherin）表达情况；实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测胶原I（CollagenI, Col-I）以及胶原IV（CollagenIV, Col-IV）的基因表达；蛋白质免疫印迹实验（Western blot）检测肾组织CD36表达水平；酰基-生物素置换实验(Acyl-Biotinyl Exchange, ABE)联合Western blot检测肾组织中CD36棕榈酰化水平。 第二部分：将人肾近曲小管上皮细胞系（Human renal proximal tubular epithelial cells, HK-2）按不同干预措施分为3组，并给予CML及抑制蛋白棕榈酰化药物2-溴软脂酸乙烯(2-Bromopalmitate,2-BP)处理，分别为对照组（Ctrl组）、CML组（给予CML100ug/ml）、CML+2-BP组（给予CML100ug/ml+2-BP150umol/L）。同时，在HK-2细胞中，转染慢病毒，使 HK-2细胞高表达野生型 CD36(WTOE)或棕榈酰化位点突变的CD36(AA-SS)，构建稳定细胞系，并予以CML100ug/ml处理。上述细胞经处理24小时后，Western blot检测细胞EMT相关指标（α-SMA、E-cadherin、波形蛋白，vimentin）以及 CD36表达水平；ABE联合Western blot检测细胞中CD36棕榈酰化水平。 第三部分：利用第一部分的动物模型，免疫组织化学法检测肾组织中具有棕榈酰基转移酶活性的蛋白 DHHC4、DHHC6表达；利用第二部分的细胞模型，Western blot检测细胞DHHC4、DHHC6及SelN的表达，ABE联合Western blot检测DHHC4、DHHC6的酶活性，并采用免疫共沉淀法检测SelN与DHHC4、DHHC6的结合情况；对HK-2细胞进行SelN RNA干扰后给予CML100ug/ml处理，ABE联合Western blot检测DHHC6的酶活性以及CD36棕榈酰化水平，Western blot检测细胞EMT相关指标（α-SMA、E-cadherin、vimentin）。 结果：第一部分：成功构建糖尿病肾病动物模型。与CON组比较，第8周末DKD组小鼠随机血糖、血清尿素氮、血清及肾组织CML水平、24小时进食量、24小时尿量、24小时饮水量、24小时尿总蛋白（ UTP）、肾组织胶原 Col-I以及 Col-IV的基因表达均明显升高（P＜0.05），但血清白蛋白、体重均明显降低（P＜0.05）。HE染色提示DKD组小鼠肾脏基质明显增生，天狼猩红染色提示DKD组小鼠肾脏纤维化程度明显高于CON组小鼠，免疫组化染色提示DKD小鼠肾脏表达的α-SMA高于CON组小鼠，但E-cadherin低于CON组小鼠。ABE联合Western blot提示DKD组小鼠肾组织CD36棕榈酰化水平较CON组小鼠明显升高（P＜0.05）。上述结果提示糖尿病肾病小鼠肾组织启动纤维化进程，AGES以及CD36棕榈酰化有可能参于该病理进程。 第二部分：Western blot提示在HK-2细胞中，CML明显提高α-SMA、vimentin表达水平（P＜0.05），但降低E-cadherin表达（P＜0.05），2-BP可以减弱CML上述的作用。ABE联合Western blot提示CML明显促进HK-2细胞中CD36棕榈酰化（P＜0.05），该作用同样可被2-BP抑制。上述结果提示CML可以促进HK-2细胞EMT，外源性CD36棕榈酰化抑制剂可以改善上述作用。进一步在CML处理的HK-2细胞中， CD36棕榈酰化位点突变明显降低α-SMA、vimentin表达水平（P＜0.05），但升高E-cadherin表达（P＜0.05）。上述结果提示CML通过促进CD36棕榈酰化以诱导肾小管上皮细胞EMT。 第三部分：ABE以及Western blot提示，CML可以提高HK-2细胞中DHHC6酰基转移酶活性及SelN表达水平（P＜0.05）。生物信息学预测DHHC6可以和SelN结合，免疫共沉淀结果同样提示SelN可以和DHHC6形成复合物。在CML处理的HK-2细胞中，SelN siRNA降低DHHC6酰基转移酶活性、CD36棕榈酰化水平、α-SMA及vimentin表达水平（P＜0.05），但升高了E-cadherin表达（P＜0.05）。上述结果提示，在肾小管上皮细胞中，CML可以提高 SelN表达水平，利于 SelN与DHHC6形成复合物，促进两者共同发挥功能，提高DHHC6酰基转移酶活性以增加CD36棕榈酰化水平。 结论： 1.糖尿病肾病小鼠肾组织纤维化进程的启动与 CD36棕榈酰化及AGES水平密切相关。 2.在肾小管上皮细胞中，AGES通过提高CD36棕榈酰化水平促进肾小管上皮细胞EMT发生。 3.在肾小管上皮细胞中，AGES通过促进 SelN/DHHC6复合物的形成，增强DHHC6棕榈酰基转移酶活性，从而提高CD36棕榈酰化水平。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 糖尿病肾病小鼠肾组织启动纤维化进程以及CD36棕榈酰化的水平

1 材料和方法

2 实验结果

3讨论

第二部分 糖基化终末产物通过促进CD36棕榈酰化诱导肾小管上皮细胞间充质转分化

1 材料和方法

2 实验结果

3讨论

第三部分 糖基化终末产物通过上调硒蛋白N表达水平促进CD36棕榈酰化

1 材料和方法

2 实验结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:蛋白质棕榈酰化相关酶的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的论文