锌-α2-糖蛋白在癫痫形成分子机制中作用的研究

摘要

第一部分:ZAG在癫痫患者及癫痫动物模型脑组织中的表达 目的:探究ZAG在难治性TLE患者皮质及PTZ点燃癫痫大鼠模型海马、皮质组织中的表达及其表达变化。 方法: 1.收集脑外伤患者手术切除的皮质为对照组(n=20)，TLE患者行癫痫灶切除的皮质为癫痫组(n=14)。同时，建立PTZ大鼠癫痫模型(n=20)，对照组大鼠腹腔注射生理盐水(n=20); 2.运用免疫荧光双标技术研究颞叶癫痫患者和癫痫大鼠脑组织中ZAG的细胞定位。运用RT-qPCR、免疫组织化学及Western blot方法测定癫痫患者和癫痫大鼠脑组织中AZGP1 mRNA和ZAG蛋白表达量的差异; 3.运用蛋白免疫印迹方法检测PTZ腹腔注射1天、1周、2周、3周和4周的大鼠脑组织中ZAG的蛋白表达量的变化情况。 结果: 1.免疫荧光染色结果显示，ZAG主要表达于人脑组织以及大鼠脑组织中的神经元胞质; 2. RT-qPCR结果显示癫痫患者及癫痫大鼠脑组织中AZGP1的mRNA水平较对照组明显降低(P＜0.05); 3.免疫组织化学染色和Western blot结果显示ZAG在癫痫患者以及癫痫大鼠模型中水平下降(P＜0.05); 4.在癫痫模型大鼠脑组织中的ZAG表达水平随PTZ注射时间的延长呈进行性加重。 结论:ZAG存在于脑组织中，且其可能是由神经元合成，而不是星形胶质细胞。AZGP1 mRNA及ZAG蛋白表达水平在TLE患者与癫痫大鼠模型脑组织中均下降。癫痫大鼠模型脑组织中ZAG蛋白水平与PTZ注射时间呈负相关。ZAG的下降可能在癫痫的发病机制及病理生理中具有重要作用。 第二部分:ZAG在癫痫发作中的作用机制 目的:探索ZAG在癫痫中的可能作用机制。 方法: 1.验证AAV的转染效果：将成年雄性SD大鼠随机分为四个组(n=20)：对照组(Control)、空病毒组(GFP)、AAV注射后3周组(AZGP1-3W)及、AAV注射后9周组(AZGP1-9W)。运用激光共聚焦显微镜观察、RT-qPCR及Western Blot分别检测AAV注射后3周及9周的转染效果； 2.探索过表达AZGP1在PTZ大鼠模型中可能的作用机制：另取45只SD大鼠随机分为三个组：对照组(Control)、癫痫组(GFP+PTZ)及过表达病毒组(AZGP1+PTZ)。AZGP1+PTZ与GFP+PTZ组大鼠在AAV注射后3周起，每日接受PTZ腹腔注射共28天，Control组大鼠接受同等剂量的生理盐水腹腔注射。观察各组大鼠的行为学及脑电图(EEG)差异。运用Co-IP检测癫痫组大鼠脑组织中ZAG与p-ERK及ZAG与TGFβ之间是否存在相互结合。运用Western Blot检测各组之间大鼠脑组织中炎症因子TNFα，IL-6，TGFβ，ERK及p-ERK的表达变化情况。 结果: 1. AAV-AZGP1和AAV-GFP海马立体定位注射后，绿色荧光结果显示海马CA3区有GFP阳性表达。RT-qPCR及免疫印迹及结果显示，与相应时间点对照组相比，AZGP1过表达组AZGP1 mRNA及ZAG蛋白在病毒注射后第3周和第9周显著增加(P＜0.05)； 2. Co-IP结果显示ZAG可以与p-ERK及TGFβ结合； 3.过表达AZGP1可以降低PTZ诱导的癫痫大鼠模型的癫痫发作评分，延长PTZ点燃的潜伏期，并缓解癫痫样放电的程度； 4.过表达AZGP1可以减轻PTZ癫痫模型大鼠的脑组织中TNFα, IL-6, TGFβ水平的升高，并降低ERK的磷酸化水平。 结论:ZAG可能通过与TGFβ及pERK之间的相互作用参与癫痫发生。ZAG可能通过抑制TGFβ介导的ERK磷酸化以及TNFα和IL-6介导的神经炎症从而抑制癫痫发作。ZAG可能是治疗癫痫的潜在新靶点。

目录

声明

英汉缩略语对照

前言

第一部分 ZAG在癫痫患者及癫痫动物模型脑组织中的表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 ZAG在癫痫发作中的作用机制

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述:炎症在癫痫中作用的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表论文和学术成果