锌指核酸酶靶向破坏bcr-abl基因清除慢性髓细胞白血病致病根源

摘要

慢性髓细胞白血病（chronic myelogenous leukemia, CML）是一种起源于造血干细胞的骨髓增殖性肿瘤，主要累及粒系，以9号染色体和22号染色体易位形成的bcr-abl融合基因为发病特征。由bcr-abl编码形成的BCR-ABL癌蛋白具有很强的酪氨酸激酶活性，异常激活多个下游效应分子，最终导致髓系细胞的恶性增殖和转化。目前，以伊马替尼（ imatinib, IM）为代表的酪氨酸激酶抑制剂（ tyrosine kinase inhibitors, TKIs）为治疗CML的一线用药，但是由于Abl激酶区多种突变的存在，使得TKIs耐药率逐年上升。而且TKIs只能抑制Abl的激酶活性，不能使bcr-abl基因转为阴性，特别是白血病干细胞（leukemia stem cell, LSC）对TKIs不敏感，成为该病复发和耐药的根源。因此，探索基于破坏bcr-abl基因的根治CML的新型治疗策略迫在眉睫。 基因编辑技术为实现靶向破坏bcr-abl基因提供了可能性，并且我们惊讶地发现bcr-abl序列的特征非常符合锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）的设计要求。在本研究中，运用模块组装策略构建靶向 bcr-abl的高特异性 ZFNs，并巧妙地利用同源重组修复（homology-directed repair, HDR）方式将含有8个碱基的NotI酶切位点插入到bcr-abl编码区中造成移码突变，使得BCR-ABL蛋白在翻译过程中提前遭遇终止密码子，最终导致BCR-ABL蛋白提前终止翻译。本课题初步探究基于ZFNs的新型基因治疗方法能否实现对bcr-abl基因的靶向破坏，并在此基础上分析该方法对BCR-ABL及其下游效应分子的表达和活化的影响，以及对CML细胞和CML CD34+细胞的生物学效应和对K562/G01耐药株在小鼠体内白血病致病能力的影响及其机制。旨在为CML基因治疗提供理论基础和依据。 采取的主要研究方法是： 1.锌指核酸酶的设计与构建及其活性验证。通过软件分析bcr-abl序列获得最适合构建ZFNs的位点，并以此为靶点构建ZFNs和含有NotI酶切位点的同源模板Donor；将ZFNs转染入K562细胞后，通过western blot，免疫荧光和测序实验来探究ZFNs的活性以及其在细胞中的表达和定位情况；将ZFNs和Donor同时转染入IM敏感细胞株K562和耐药细胞株K562/G01，以探究其在bcr-abl基因中插入8个碱基后，对BCR-ABL及其下游效应分子的表达和活性的影响。 2.锌指核酸酶对慢性髓系白血病细胞增殖和凋亡的作用及机制。用pAd-Track，ZFN-L，ZFN-R，Donor以及ZFN-L/R+donor（ZFNs和Donor共转染）质粒分别转染K562，K562/G01，CML CD34+细胞和正常对照组细胞。通过CCK-8和克隆形成实验来检测细胞增殖情况；流式细胞术和DAPI染色分析对细胞凋亡的影响；Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP。 3.锌指核酸酶对K562/G01细胞致小鼠白血病的影响。分别用pAd-Track， ZFN-L， ZFN-R， Donor以及ZFN-L/R+donor质粒转染K562/G01细胞，随后通过尾静脉将上述五组细胞和未处理的K562/G01细胞分别注射到六组小鼠体内构建K562/G01-NOD/SCID小鼠血液瘤模型。观察小鼠的生存状态，外周血白细胞数以及其中CD45+细胞百分率和小鼠生存期；当小鼠出现精神萎靡，跛行，毛色无光泽，消瘦或当实体瘤严重影响其基本生活时采用颈椎脱臼法处死；取小鼠的肝脏，脾脏，骨髓和实体瘤进行称重，测量和拍照；将组织固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋，切片，HE染色观察各个组织中白血病细胞的浸润情况；制作组织细胞涂片，免疫荧光检测各组织中BCR-ABL的表达情况。 取得的实验结果与结论如下： 1.成功构建了靶向bcr-abl的ZFNs。Western blot结果证实，该ZFNs能在K562细胞中表达，并且定位于细胞核中。免疫荧光结果显示ZFNs具有DNA编辑活性，能使靶序列发生DNA双链断裂。当ZFNs和Donor同时转染入K562和K562/G01细胞后，在bcr-abl编码区插入由8个碱基组成的NotI酶切位点，并且当这8个碱基插入后，在DNA双链断裂位点下游不远处就遭遇终止密码子，成功使BCR-ABL蛋白表达下调，并使其下游效应分子的活化被抑制。构建的ZFNs能特异性靶向并切割bcr-abl，并且当同源模板Donor存在时，通过HDR将8个碱基插入到bcr-abl编码区中，最终使BCR-ABL蛋白翻译提前终止。 2.在K562和K562/G01细胞中共转染ZFNs和Donor后，可以抑制细胞的增殖并促进细胞凋亡，而对于32D，293T和HepG2的细胞增殖和凋亡没有明显的影响。在干祖细胞中，我们也获得相同的结论：共转染ZFNs和Donor可以抑制CML CD34+细胞的增殖并促进其凋亡，而对正常 CD34+细胞的生物学效应没有明显影响。构建的ZFNs能特异性靶向并杀伤bcr-abl阳性细胞和CML CD34+细胞，并且对bcr-abl阴性细胞和正常CD34+细胞具有较小的细胞毒性作用。 3. ZFN-L/R+donor组的小鼠，其生存时间要明显长于其他各对照组，并且该组小鼠的基本情况较好，外周血白细胞数以及肝脾重量明显低于其他各对照组，而且该组没有小鼠出现实体瘤生长，组织病理检查也证实白血病细胞浸润情况与其他组相比明显得到改善。ZFNs和Donor共转染能抑制K562/G01细胞在小鼠体内的致白血病能力。 综上所述，我们成功构建了靶向bcr-abl基因的高活性ZFNs，并在同源模板存在的情况下，通过HDR在bcr-abl编码区中插入了8个碱基，提前终止了BCR-ABL蛋白的翻译，实现了对bcr-abl基因的靶向破化，清除了CML的致病根源。本课题首次将ZFN-donor组合策略引入CML治疗并初步取得较好的实验结果，这可能为对伊马替尼耐药或不耐受的CML患者提供了一种新的治疗策略。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 锌指核酸酶的设计与构建以及活性验证

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

第二部分 锌指核酸酶对慢性髓细胞白血病细胞增殖和凋亡的作用及机制

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

第三部分 锌指核酸酶对K562/G01细胞致小鼠白血病能力的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

全文总结

课题的创新之处

课题不足及后续研究计划

文献综述:基因编辑技术运用于临床治疗的前景与挑战

致谢

攻读博士学位期间发表的论文