基于高通量测序技术鉴定肝细胞肝癌的遗传变异和功能基因

摘要

研究背景和目的： 肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球常见的恶性肿瘤之一，每年的发病人数约为523,432例，其中中国发病人数约占总病例数56%。肝细胞肝癌的病因包括：乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus， HBV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染、酗酒、黄曲霉素以及非酒精性脂肪肝等。目前，对于HCC发生的分子机制有很多新进展。肝癌组织中存在许多基因组的改变，包括表达调控的变化、染色体结构异常以及单核苷酸变异等，已经发现基因突变以及表达调控发生变化均与HCC的发展有重要关系。目前与人类肝癌的发生有关的驱动基因（Driver gene）有：TP53、ARID1A、CTNNB1、NRAS、RB1、BCL9、CDKN2A和PTEN等，但仍有许多与肝癌发生发展相关的基因有待进一步确定，并且肝癌组织中体细胞突变表达模式以及表达调控网络未被深入研究。 方法： （1）我们以9个HBV相关HCC组织以及匹配的硬化组织为研究对象，对其mRNA测序（RNA-Seq）数据进行加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA），以研究差异表达基因（Differential expression gene，DEG）与HCC患者临床特征（如肿瘤分级和甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP）水平）之间的关系，从而探究肝癌组织和硬化组织间的表达模式；鉴定出与HCC临床特征有关的重要基因模块；发现新的与肝癌发展有关的生物调控网络；找到网络中具有重要作用的枢纽基因（Hub gene）；并采用定量逆转录-聚合酶链式反应（Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）的方法对枢纽基因进行验证。 （2）我们对12个HCC组织、匹配硬化组织以及全血样本进行全外显子组测序（Wholeexome sequencing，WES），识别肝癌组织体细胞突变的情况及描述HCC突变模式。随后，结合其中9个HCC患者的癌组织以及匹配硬化组织的转录组测序（Transcriptome sequencing）数据，描绘HCC体细胞突变表达模式并鉴定出新的HCC相关候选基因，在癌症基因组图谱计划中（TheCancer Genome Atlas，TCGA）对相关候选基因进行深度挖掘，找出其参与调控的关键信号途径，发现其在信号途径中扮演的重要作用。 结果： （1）我们在9个 HBV相关 HCC组织及其匹配的硬化组织的RNA-Seq数据中共鉴定到747个差异表达基因（DEGs），然后运用WGCNA识别了11个基因模块，其中MEtan模块与血清AFP水平显著相关，并鉴定到MEtan模块中的15个具有显著意义的枢纽基因（hub gene）。我们识别的模块在另外两组HCC RNA-Seq数据集中具有较好的保真度和一致性。我们在与血清AFP水平显著相关的MEtan模块内筛选了4个枢纽基因（SPX、AFP、ADGRE1和EXO1）进行qRT-PCR验证，最终3个枢纽基因（SPX、AFP和ADGRE1）的差异表达具有显著意义。 （2）在12个HCC患者的WES数据中共识别到1,554个非沉默性突变（类型包括：错义突变（Missense mutation）、无义突变（Nonsense mutation）、剪切位点（Splicesite）以及翻译起始位点（Translation start sites）），在肝癌组织体细胞突变中，A到T或T到A的替换所占比例最高。我们发现体细胞累积突变主要发生在肝癌阶段，其体细胞突变发生率（Prevalent）显著高于肝硬化阶段。此外，我们识别了两个显著突变的基因（TP53和KRTAP4-3），这两个基因可能在HCC发生过程中具有重要作用。随后，我们联合9对HCC样本的RNA-Seq数据进行突变等位基因转录模式分析，鉴定到一个新的 HCC相关候选基因（VPS35），该基因突变和差异表达在TCGA HCC队列中均与不良生存率显著相关（p=3.3E-2，2E-3）。VPS35在RTK/Ras/PI(3)K信号途径中与FGFR3协同调控NRAS的表达，并且VPS35与RTK/Ras/PI(3)K信号途径的基因在特定的HCC亚型组中表现为高表达。 结论： 高通量测序（High-throughput sequencing）技术在几年内迅速发展，广泛地应用于生命科学领域。对于复杂性疾病研究的显著推动就是改变了宏观基因组学的分析策略。高通量测序技术应用于肝癌研究，不仅能在分子层面鉴定与肝癌临床表型有关的枢纽基因，还能识别HCC体细胞突变表达模式，为进一步探索HC C的发病机制提供新的思路和理论基础，对理解HCC的分子遗传基础具有启示意义。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分：加权基因共表达网络分析（WGCNA）在肝细胞肝癌转录组数据中的应用

1材料和方法

2结果

3讨论

第二部分：整合全外显子组和转录组测序数据鉴定新的肝细胞肝癌相关候选基因

1材料和方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:肝癌基因组的研究进展

致谢

攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录