低频低强度超声联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对耻垢分枝杆菌的协同杀菌效果研究

摘要

研究意义： 结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的世界第二大传染病。我国是结核病高流行国家，且新发病例数远高于国际平均水平，结核病的防控面临着严峻挑战[1-2]。MTB的细胞壁很厚，其中含有大量脂质，能阻碍药物通过细胞壁间隙进入菌体内，导致多种抗生素对其天然耐药[3-4]。这也是临床上治疗效果不显著、治疗周期长、耐药菌株不断增多的原因。 聚乳酸羟基乙酸[poly(Plactic-co-glycolic acid），PLGA]是由乳酸和羟基乙酸聚合而成的高分子材料，其具有生物相容性、可降解性等多种特性，现已被广泛的应用于生物医学领域[5]，且超声联合载药微泡在抗感染等方面已展示出良好的前景。 耻垢分枝杆菌（Mycobacteria smegmatis，MS）具有相似于MTB遗传学特性，没有生物危害性，故本文选用MS作为研究对象。我们选用抗结核药物左氧氟沙星，制备载左氧氟沙星PLGA纳米粒，并联合低频低强度超声（Low-frequency and Low-intensity，LFLIU）体外辐照MS菌悬液，探究其协同杀菌的作用，有望为研究超声联合载药PLGA纳米粒治疗结核病奠定基础。 目的： 针对抗酸杆菌细胞壁结构的特殊性，探究LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对MS的协同杀菌效果，有望为临床上抗结核治疗提供一种新的治疗方法。 方法： 1．载左氧氟沙星PLGA纳米粒的制备及特性比较：采用双乳化法制备3种PLGA纳米粒，即载左氧氟沙星PLGA纳米粒、空PLGA纳米粒、载绿色荧光葡聚糖PLGA纳米粒。 （1）光镜与电镜下观察PLGA纳米粒的形态，马尔文激光粒度仪检测PLGA纳米粒的粒径与电位； （2）激光共聚焦显微镜观察载绿色荧光葡聚糖纳米粒荧光包裹情况； （3）分光光度计检测载左氧氟沙星PLGA纳米粒12h内药物的自动缓释效率； （4）分光光度计检测载左氧氟沙星PLGA纳米粒在0.15W/cm2、0.3W/cm2超声剂量下10min内药物释放的效率。 2．不同超声剂量和辐照时间以及不同药物浓度对MS的协同杀菌效果研究：选用频率为42KHz，声强0.15-0.6W/cm2连续可调，换能器直径为1.5cm的LILFU设备。 （1）检测左氧氟沙星对MS的最小抑菌浓度，以参考确定实验用药浓度， （2）超声强度与辐照时间分别为:0.15W/cm2,5min。用0.125μg/ml、0.25μg/ml（同纳米粒内药物浓度）左氧氟沙星及载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LILFU协同杀菌，培养36h用平板菌落计数法计算细菌活力，评价超声联合不同浓度载左氧氟沙星PLGA纳米粒对MS的协同杀菌作用。 （3）超声辐照时间5min，药物浓度选择0.125μg/ml、0.25μg/ml。用不同超声强度0.15W/cm2、0.3W/cm2LILFU联合左氧氟沙星及载左氧氟沙星PLGA纳米粒协同杀菌，培养36h用平板菌落计数法计算细菌活力，评价不同强度超声联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对MS的协同杀菌作用。 （4）超声强度0.15W/cm2，药物浓度选择0.125μg/ml、0.25μg/ml。在不同辐照时间5min、10min,用LILFU联合左氧氟沙星及载左氧氟沙星PLGA纳米粒协同杀菌，培养36h用平板菌落计数法计算细菌活力，评价不同辐照时间LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对MS的协同杀菌效果。 结果： 1．3种PLGA纳米粒物理特性及释放效率： （1）光镜及电镜下显示，3种PLGA纳米粒大小均匀、呈球形，分散度良好。马尔文激光粒度仪检测载左氧氟沙星PLGA纳米粒粒径为282.5?2.5nm，表面电荷为-18.5?0.8。激光共聚焦显微镜下可见载绿色荧光葡聚糖PLGA纳米粒发出绿色荧光，表明绿色荧光葡聚糖成功载入PLGA纳米粒。 （2）载左氧氟沙星PLGA纳米粒的载药率及包封率分别为1.04%，21.40%，但载绿色荧光葡聚糖PLGA纳米粒的载药率高于载左氧氟沙星PLGA纳米粒，为2.70%，可能与不同物质的极性有关。 （3）载左氧氟沙星PLGA纳米粒12h内药物释放率结果显示，在最初2h为突释过程，累计释放率为22.87%，经过8h后，药物释放趋于平稳，到达12h后，释放药物的量占总量的57.64%。 （4）当LILFU辐照载左氧氟沙星PLGA纳米粒后，其药物释放率明显提高。当LILFU声强为0.15W/cm2、0.3W/cm2辐照10min后，药物释放量短时间内达到50%以上，两者辐照10min释放率差异不大，可见LILFU可促进纳米粒破裂，提高药物释放率。 2.LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒具有协同抗菌作用： （1）左氧氟沙星对MS的最小抑菌浓度为0.25μg/ml。 （2）当超声声强与辐照时间相同条件下，不同浓度药物及载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU对耻垢分枝杆菌的杀菌效果显示，杀菌效果会随着药物浓度升高而越好。而超声联合药物组杀菌效果优于游离药物组，而载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU组杀菌效果优于LFLIU联合游离药物组，载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU组杀菌效果显著，其中0.25μg/ml载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU的细菌存活率为42.56%，与其他组相比最低。 （3）在不同超声声强下，声强越高，杀菌效果越明显。超声联合药物组杀菌效果优于单独超声组，而载左氧氟沙星PLGA纳米粒组杀菌效果优于药物组。当声强为0.3W/cm2时， LFLIU联合载左氧氟沙星纳米粒组细菌存活率最低，为35.26%。 （4）在超声辐照不同时间下，随着超声辐照时间延长，载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU杀菌效果越明显，较其他组细菌存活率最低为39.21%。 结论： 1.本实验采用双乳化法成功制备了形态大小均一、包封率较高且生物毒性低的载左氧氟沙星 PLGA纳米粒。2.载左氧氟沙星PLGA纳米粒联合LFLIU辐照对MS具有高效协同杀菌作用。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 PLGA纳米粒的制备及物理特性比较

1材料和方法

2实验结果

3讨论

4小结

第二部分 低频低强度超声联合左氧氟沙星PLGA纳米粒对耻垢分枝杆菌的协同杀菌效果研究

1材料和方法

2实验结果

3 讨论

4 小结

全文总结

参考文献

文献综述:超声联合载药微泡在生物医学中应用进展

致谢

攻读硕士学位期间已发表的学术论文