人参皂苷Rg1调控Wnt/β-catenin信号通路延缓神经干细胞衰老的机制研究

摘要

目的: 脑衰老已成为当今神经科学与衰老生物学领域的重点研究课题。研究证明，脑衰老将引起诸多中枢神经系统退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病等。人参是中医临床“补气要药”，其主要药效成分是人参皂苷，但其组分多达几十种。我们前期研究证明，人参皂苷 Rg1是人参中的抗衰老单体成分，它能有效拮抗致衰剂，延缓小鼠脑衰老，提高衰老小鼠学习记忆能力，并初步探讨了其延缓脑衰老与调控神经干细胞衰老（neural stem cells，NSCs）的关系，但Rg1调控NSCs衰老机制尚不清楚。最新研究证明，Wnt/β-catenin信号通路的过度激活与干细胞衰老密切相关，Rg1延缓NSCs衰老是否与调控该信号通路有关值得深入研究。 本研究中的巢蛋白-绿色荧光蛋白（Nestin-GFP）转基因小鼠衰老模型，是运用D-半乳糖（D-gal）来构建的，探讨人参皂苷Rg1保护或延缓小鼠海马衰老与调控NSCs衰老的关系，旨在阐释Rg1是否能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的过度激活调控NSCs衰老，研究将为寻找延缓脑衰老的新方法提供理论与实验依据。 方法: 1．衰老小鼠模型构建与给药处理：随机的将40只雄性Nestin-GFP转基因小鼠平均分为4组。衰老组：小鼠皮下注射 D-gal（200mg/kg qd×42d）；Rg1衰老组：按衰老组方法注射D-gal，第16d起腹腔注射人参皂苷Rg1（40mg/kg qd×27d）；Rg1对照组：小鼠皮下注射等量生理盐水（200mg/kg qd×42d），第16d起注射人参皂苷（剂量与时间同Rg1衰老组）；对照组：小鼠注射等量与等时生理盐水。衰老模型建立与给药完成后第2d进行相关实验。 （1）各组小鼠动态情况观察； （2）Rg1对小鼠学习记忆能力的影响：建模完成第2d开始Morris水迷宫实验，检测小鼠的空间学习记忆能力； （3）Rg1对NSCs相对数量影响的影响：摘取鼠头，完整收取四组小鼠新鲜海马组织并做各组冷冻切片，分析各组海马区NSCs的荧光强度； （4）Rg1对NSCs衰老的影响：分析各组海马组织中衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色NSCs的阳性百分率； （5）Rg1对海马组织氧化与抗氧化指标影响：制备海马组织匀浆，检测匀浆中SOD、T-AOC与MDA含量； （6）Rg1对海马组织炎症因子的影响：海马组织匀浆中 IL-1β、IL-6及TNF-α含量检测； （7）Rg1对海马组织衰老相关蛋白的影响：采用Western blotting实验方法检测海马组织的P53、P21蛋白表达量。 2.摘取Nestin-GFP转基因新生鼠全脑，提取NSCs，培养至P3代，检测以下指标： （1）NSCs培养鉴定：培养NSCs的Nestin自带绿色荧光，标记Sox2标记红色荧光。 （2）氯化锂对 NSCs增殖与存活率影响检测：在不同浓度（5mmol/l，10 mmol/l，20 mmol/l，40 mmol/l）的氯化锂培养基（Wnt/β-catenin信号激动剂）中分别培养第P3代NSCs，培养1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d后，用CCK-8方法检测各组细胞增殖与存活率。 （3）人参皂苷Rg1对NSCs增殖与存活率影响检测：在不同浓度的人参皂苷 Rg1培养基（5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml）分别培养第P3代NSCs，培养1d、2d、3d、4d后，用CCK-8方法检测各组细胞OD值。 （4）人参皂苷Rg1与氯化锂（Wnt/β-catenin信号激动剂）对NSCs增殖与存活率影响：将培养第P3代NSCs随机平均分成四组。氯化锂组：第P3代NSCs在终浓度20 mmol/l的氯化锂培养基培养48h；Rg1+氯化锂组：第P3代NSCs在氯化锂培养基培养（剂量同氯化锂组）24h，加入人参皂苷 Rg1（终浓度20μg/ml）继续培养24h；Rg1组：第 P3代NSCs在常规培养基培养24h，再加人参皂苷Rg1（剂量同Rg1+氯化锂组）继续培养24h；对照组：第P3代NSCs在常规培养基中培养48h。检测以下指标： 1）光学显微镜观察各组NSCs生长情况； 2）流式检测各组细胞的细胞周期； 3）Brdu检测各组细胞增殖能力； 4）荧光显微镜观察各组NSCs的Nestin和Sox2荧光强度； 5）各组神经球SA-β-Gal染色分析衰老染色阳性率； 6）激光共聚焦观察各组NSCs的β-catenin定位； 7）Western Blotting检测各组 Wnt/β-catenin通路相关蛋白含量变化。 结果: 1.体内结果 1）衰老组小鼠毛色逐渐晦暗，精神萎靡且嗜睡，饮食减少，体质量增加缓慢，呈自然衰老体征。而对照组、Rg1组和Rg1衰老组小鼠无明显相关体征。 2）Morris水迷宫实验结果表明，衰老组小鼠空间学习记忆能力明显降低，而Rg1衰老组小鼠空间学习记忆能力显著改善； 3）免疫荧光观察结果显示，衰老组小鼠海马DG区Nestin-GFP绿色荧光强度明显降低，而Rg1衰老组小鼠海马DG区Nestin-GFP绿色荧光强度增加； 4）SA-β-Gal染色结果显示，衰老组小鼠海马CA3区Sa-β-gal染色阳性颗粒数明显增高，而 Rg1组和 Rg1衰老组小鼠海马 CA3区Sa-β-gal染色阳性颗粒数明显减少； 5）氧化与抗氧化能力检测显示，和正常对照组比较，衰老组小鼠海马组织匀浆的SOD活性及T-AOC降低，而MDA含量升高；而Rg1衰老组海马组织匀浆SOD及T-AOC活性较衰老组升高，MDA含量降低； 6）ELISA检测结果显示，衰老组小鼠海马匀浆中IL-1β、IL-6和TNF-α含量明显升高，而 Rg1衰老组小鼠海马区 IL-1β、IL-6以及TNF-α含量显著减少； 7）Western Blotting检测显示，衰老组小鼠海马区P53、P21蛋白含量明显升高，而Rg1衰老组小鼠海马区P53、P21蛋白含量明显减少。 2.体外结果 1）各组NSCs生长情况观察表明：氯化锂组神经球大小不一，数量减少，而Rg1+氯化锂组神经球大小规则，数量显著增多； 2）流式检测各组细胞周期表明：氯化锂组NSCs的S和G2期细胞百分率减少，G1期细胞百分率增多，Rg1+氯化锂NSCs的S和G2期细胞百分率较氯化锂组升高，G1期细胞百分率降低； 3）Brdu检测各组细胞增殖能力表明：氯化锂组NSCs的增殖能力降低，Rg1+氯化锂组NSCs的增殖能力增强； 4）荧光显微镜观察各组Nestin和Sox2荧光强度表明：各组NSCs的荧光强度无明显区别； 5）各组神经球Sa-β-gal衰老染色阳性率：氯化锂组神经球衰老染色阳性率升高，Rg1+氯化锂组神经干细胞球衰老染色阳性率降低； 6）各组 NSCs的β-catenin分布情况：氯化锂组 NSCs细胞质β-catenin较少且细胞数量少。Rg1+氯化锂组NSCs细胞质β-catenin较多且细胞数量较多； 7）Western Blotting检测各组细胞Wnt/β-catenin通路相关蛋白含量变化表明：氯化锂组Wnt/β-catenin通路激活相关蛋白含量升高，Rg1+氯化锂组Wnt/β-catenin通路激活相关蛋白含量降低。 结论: 1.D-gal可复制脑衰老模型，人参皂苷Rg1能拮抗D-Gal所致小鼠脑衰老，其可能机制与Rg1拮抗致衰剂对海马NSCs的氧化应激损伤，并调节下游P53-P21信号通路密切相关； 2.氯化锂可以激活NSCs的Wnt/β-catenin信号通路,人参皂苷Rg1能拮抗Wnt/β-catenin信号通路激活所导致的NSCs衰老从而延缓脑衰老。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分：人参皂苷 Rg1对 D-半乳糖所致衰老小鼠海马的保护机制

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分：人参皂苷Rg1调控神经干细胞Wnt/β-ca tenin信号通路延缓脑衰老作用机制的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

文献综述:脑衰老特征及机制研究

1脑组织衰老

2 NSCs衰老

3 NSCs移植应用

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文