载声敏剂液态氟碳纳米粒预定位靶向增强HIFU消融的实验研究

摘要

高强度聚焦超声（HighIntensityFocusedUltrasound, HIFU）是将体外发射的超声能量聚焦到体内靶组织，在局部产生瞬态高温、高压，使组织产生不可逆的凝固性坏死，最终实现病灶切除的目的。为了增加HIFU消融效率以及减少并发症，学者们尝试运用不同的增效剂，如碘油、羟基磷灰石、超声微泡、液态氟碳纳米粒、介孔二氧化硅、声敏剂等。目前液态氟碳纳米粒被认为是一种非常具有潜能的增效剂，因为液态氟碳常温下为液态，当温度升高或超声辐照能使其发生液气相变，产生微气泡，从而增加 HIFU治疗的空化效应。同时学者 Yan将声敏剂与高分子材料相结合，制备了载血卟啉单甲醚高分子纳米粒增效剂，将HIFU与声动力化学疗法(SonodynamicChemistryTherapy, SDT)有机结合。若进一步将液态氟碳纳米和声敏剂结合，制备一种载声敏剂的液态氟碳纳米粒，在HIFU辐照下发生液气相变，产生微气泡，不仅能改变组织声环境，同时增加空化效应并激活声敏剂，从而实现HIFU增效与声动力化学疗法的协同作用。为了利用增效剂进行更精准的治疗，需要对增效剂进行修饰，使其具有靶向性能。生物素-亲和素预定位技术源于肿瘤放射免疫显像与治疗，二步法先将寻靶分子注射入体内，待其在肿瘤部位达到峰值时，再注射效应分子，具有高灵敏性、高特异性和广适应性等优点；同时仅需对抗体和效应分子进行生物素和亲和素化修饰，制作相对简单。该技术已在影像学其它领域如MRI分子成像中得到应用，但少有将其运用在超声分子靶向研究。因此本课题旨在制备一种载声敏剂的液态氟碳高分子纳米粒，然后修饰让其链霉亲和素化，最后采用预定位靶向技术靶向肿瘤并初步研究其在体内外增强HIFU消融的效果，为HIFU增效剂的制备及运用提供一种新思路。主要内容以下： 目的 1.制备载血卟啉单甲醚（HMME）液态氟碳（全氟戊烷, PFP）聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米粒(HMME+PFP/PLGA)，并检测其一般性质及观察体外增强HIFU消融效果。 2.制备链霉亲和素化载血卟啉单甲醚液态氟碳高分子纳米粒（HMME+PFP/PLGA-SA），检测其一般性质及体外预定位靶向能力。 3.观察生物素化VEGFR2介导的链霉亲和素化载血卟啉单甲醚液态氟碳纳米粒预定位靶向增效 HIFU消融裸鼠皮下乳腺癌移植瘤的效果，并探讨相关增效机制。 方法 1.采用单乳化法制备出 HMME+PFP/PLGA纳米粒，用倒置显微镜观察其形态学特点和分布情况，用 Malvern激光粒径测量仪测量其粒径大小和Zeta电位；测定其包封率；用光镜及超声显像观察温升和超声辐照对其相变的影响；体外观察其增效 HIFU消融离体牛肝的效果。取新鲜牛肝分为五组：(I)双蒸水组，(II)PLGA组，(III) PFP/PLGA组，(IV) HMME/PLGA组和(V) HMME+PFP/PLGA组。分别将200μl双蒸水及 PLGA、PFP/PLGA、HMME/PLGA、HMME+PFP/PLGA纳米粒注入不同组牛肝中，于注入点给予不同声功率（90 W，120 W，150 W）和不同辐照时间（2 s，5 s，10 s）的HIFU单次点辐照，通过测量靶区灰度变化值、凝固性坏死体积及能效因子等指标来评价HIFU消融的增效效果。 2.在制备 HMME+PFP/PLGA纳米粒基础上,采用碳二亚胺法制备 HMME+PFP/PLGA-SA，用倒置显微镜观察其形态学特点和分布情况，用Malvern激光粒径测量仪测量粒径大小和Zeta电位；测定其包封率。用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测链酶亲和素与纳米粒的连接情况；用平行板流动腔法评价流动状态下纳米粒与细胞的靶向结合情况。 3.①将70只荷瘤裸鼠随机分为7组，每组10只，分为HIFU组，PLGA＋HIFU组，PFP/PLGA＋HIFU组, HMME/PLGA＋HIFU组, HMME+PFP/PLGA＋HIFU组， HMME+PFP/PLGA-Ab＋HIFU组和HMME+ PFP/PLGA-SA＋HIFU组。HIFU组给予单纯 HIFU辐照；HMME+PFP/PLGA-SA＋HIFU组，即预定位靶向组，先通过尾静脉注射生物素化VEGFR2抗体，24小时后再经尾静脉注入200μl HMME+PFP/PLGA-SA；其余各治疗组分别经尾静脉注入200μl相应纳米粒，约5 min后行 HIFU单次点辐照，治疗参数：功率150 W，时间5 s。观察消融后靶区灰度变化值、凝固性坏死体积和能效因子， HE染色观察组织结构的变化、免疫组化法检测消融周边肿瘤组织CD34及PCNA的表达，TUNEL试剂盒检测消融周边肿瘤细胞的凋亡情况。②将12只荷瘤裸鼠随机分为2组，每组6只，分为单纯HIFU组和预定位（HMME+PFP/PLGA-SA＋HIFU）组，治疗参数和方法同前，观察治疗后裸鼠的体重、生存时间及肿瘤体积变化。 结果 1. HMME+PFP/PLGA纳米粒为均匀的咖啡色乳液，分散均匀。光镜及扫描电镜下观察其形态呈球形，表面光滑，分散度较好，大小较均匀。激光共聚焦显示HMME+PFP/PLGA发出红色荧光。 Malvern激光粒径仪测得其平均粒径为381.5±75.3nm，Zeta电位为?(14.1±0.4) mV。HMME的平均包封率为52.52±3.54％； PFP的平均包封率为44.07±1.24％。当温度升高超过45℃或 HIFU辐照时，光镜下可见HMME+PFP/PLGA发生液气相变，产生微泡，同时增强超声显影。在体外HIFU消融实验中，与其它各组相比，HMME+PFP/PLGA组在同等实验参数下靶区灰度变化值和凝固性坏死体积最大，能效因子最小（P＜0.05）。 2. HMME+PFP/PLGA-SA纳米粒为较均匀的咖啡色乳液，分散均匀。光镜及扫描电镜下观察其形态呈球形，表面光滑，分散度较好，大小较均匀。Malvern激光粒径仪测得其平均直径为477.8±81.8nm， Zeta电位为?(13.9±0.5) mV。HMME的平均包封率为46.64±3.34％；PFP的平均包封率为40.08±2.61％。与HMME+PFP/PLGA比较，其一般性质无明显改变。当温度超过45℃，可使其发生相变。激光共聚焦显微镜下载血卟啉单甲醚纳米粒呈红色，FITC标记的链霉亲和素呈绿色，两者融合，可见纳米粒表面呈黄色荧光。流式细胞仪测得纳米粒与链霉亲和素的结合效率为95.48±3.51%。平行板流动腔法,预定位靶向组（HMME+PFP/PLGA-SA）可见大量纳米粒结合在细胞的周边及表面，直接靶向组（HMME+PFP/PLGA-Ab）仅可见少量纳米粒结合到细胞表面； HMME+PFP/PLGA组、HMME/PLGA组、PFP/ PLGA组、抗体阻断组几乎没有纳米粒结合到细胞表面。 3.预定位靶向组（HMME+PFP/PLGA-SA）消融区灰度变化值及凝固性坏死体积最大，能效因子最小，与其它各组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。预定位靶向组（HMME+PFP/PLGA-SA）组 MVD和PCNA降低、AI升高，与其它各组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。预定位靶向组（HMME+PFP/PLGA-SA＋HIFU）裸鼠的荷瘤生存时间明显长于单纯HIFU组治疗组，差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论 1.自制的 HMME+PFP/PLGA纳米粒粒径均一，分散度好，包封率较高，温升及HIFU辐照能使其发生相变，体外离体牛肝实验显示其能有效增强 HIFU消融的效果。 2.采用碳二亚胺法制备的HMME+PFP/PLGA-SA纳米粒一般性质好，链霉亲和素与纳米粒的结合率高，流动状态下可见大量纳米粒结合在细胞的周边及表面，具有较强的靶向能力。 3.预定位靶向组（HMME+PFP/PLGA-SA）HIFU消融区灰度变化值及凝固性坏死体积最大，能效因子最小，与其它各组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。预定位靶向组（HMME+PFP/PLGA-SA）凝固性坏死边缘肿瘤组织的MVD和PCNA降低、AI升高，与其它各组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。预定位靶向组（HMME+PFP/PLGA-SA＋HIFU）裸鼠的荷瘤生存时间明显长于单纯HIFU组治疗组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 载血卟啉单甲醚液态氟碳纳米粒的制备及HIFU增效研究

第一节 载血卟啉单甲醚液态氟碳纳米粒的制备及基本性质检测

第二节 载血卟啉单甲醚液态氟碳纳米粒增强HIFU消融离体牛肝的实验研究

第二部分 链霉亲和素化载血卟啉单甲醚液态氟碳纳米粒的制备及基本性质和靶向能力检测

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

附图

第三部分 生物素化VEGFR2抗体介导的链霉亲和素化载血卟啉单甲醚液态氟碳纳米粒预定位靶向增效HIFU消融裸鼠肿瘤研究

1 材料与方法

2 结果

3讨论

4小结

附图

参考文献

全文总结

本课题的创新性：

本课题的不足之处及后续工作研究展望：

文献综述:高强度聚焦超声在肿瘤治疗中的应用

致谢

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