RNA Binding Motif Protein-5上调促进胶质瘤细胞A172凋亡

摘要

研究背景： 人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤之一，具有呈浸润性生长和手术难以被完全切除的特性，所以术后复发率高[1]。新近，在分子水平上探索靶向抑制胶质瘤生长的基因是持续的热点。通过查阅文献发现，肿瘤抑制基因功能的缺失是某些肿瘤的发病机制之一。位于3号染色体短臂2区1带3亚带的RNA结合模序蛋白-5(RNA Binding Motif Protein-5,RBM5)缺失导致肺癌的发生[2]，其首先作为LUCA-15于1996年被克隆出来，曾被命名为LUCA-15、RBM5、H37等，是RNA结合模序蛋白的家族成员[3]，具有调控mRNA剪切、修饰、外运、翻译和稳定性等的作用[4]，亦调控细胞的凋亡[5]。本研究探索性发现RBM5在人脑胶质瘤细胞中呈低表达状态且其表达与细胞恶性程度呈负相关。 目的： 以A172、U251、U87和SHG-44四株胶质瘤细胞为研究对象，研究RNA结合模序蛋白-5(RNA Binding MotifProtein-5,RBM5)在4种人脑胶质瘤细胞株中存在的表达差异并分析其趋势，探讨RBM5表达最低的胶质瘤细胞在上调后，促进自身凋亡的机制。 方法：临床标本的分析：收集重庆医科大学附属第一医院神经外科切除的胶质瘤标本，经病理科确诊级别后制作切片，利用免疫组化技术检测RBM5在胶质瘤组织（WHOI?IV级）中的阳性表达情况。细胞水平实验：委托上海吉凯基因公司合成含有高表达RBM5慢病毒，转染A172细胞株，再经qRT-PCR检测转染后其RBM5的表达是否升髙；流式细胞技术实验检测上调株与亲本株A172细胞的凋亡情况。分子水平实验:Trizo法提取总RNA，经逆转录成cDNA后，采用qRT-PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction)实验检测RBM5在4种胶质瘤细胞株中的表达差异；Western Blotting检测信号通路蛋白RBM5、BAX、Cleaved-Caspase-9和Bcl-2表达强弱的变化。所有结果均采用SPSS22.0统计软件分析处理。 结果： 临床标本实验结果：根据免疫组化的染色结果，计数RBM5在胶质瘤组织中的阳性表达呈棕黄色颗粒，联合图像处理ImagePro Plus软件处理后，经ANOVA检验分析得出RBM5在不同级别的胶质瘤组织中的表达存在差异（F=6.575，P＜0.05)，经独立样本〖检验得出在低级别胶质瘤（WHO I?IV级）组织中的阳性表达高于高级别胶质瘤（WHO I?IV级）组织（F=7.410，P＜0.05)。分子水平实验结果：根据qRT-PCR的结果进行单因素方差分析，RBM5在4株人脑胶质瘤细胞株中在A172细胞中表达最低，在SHG-44细胞中表达最高(F=6.023,P＜0.05);转染慢病毒后，采取ANOVA检验分析得出，实验组中RBM5在mRNA上的表达水平升髙（F=63.232，P＜0.05),而对照组和空白组无明显差异（P＞0.05);单因素方差分析Western Blotting结果，实验组中 RBM5、BAX、cytochrome c、Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspas-3的表达髙于阴性对照组和空白组（P＜0.05)，而对照组和空白组无明显差异（P＞0.05)，实验组中Bcl-2的表达明显低于阴性对照组和空白组，差异具有统计学意义（P＜0.05)，而对照组和空白组无明显差异（P＞0.05)。细胞水平实验：流式细胞技术实验检测的凋亡结果，根据流式凋亡结果的象限图进行单因素方差分析，得出空白组和对照组比较，实验组细胞的凋亡效果明显，差异具有统计学意义(F=362.528,P＜0.05)。 结论： 临床标本的结果提示RBM5可能与胶质瘤的等级呈正相关关系；通过上调A172细胞中的RBM5，发现自身的凋亡效果明显增加，提示RBM5的髙表达可能促进了凋亡的信号通路。以上结果说明RBM5基因有望成为胶质瘤临床治疗的新的分子水平靶点。

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