人TRAIL分子胞外区的克隆、表达纯化及生物学活性鉴定

摘要

TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducingligind)又叫Apo2L，是新近发现的TNF超家族成员，与TNF-α和FasL一样能诱导肿瘤细胞发生凋亡。但TNF-α和FasL的细胞毒副反应太大，无法应用于临床。TRAIL有较广的抗癌谱，能诱导对FasL和放化疗有抗性的细胞凋亡，尤其在其抗癌作用中最独特的特征是只选择性诱导肿瘤细胞和转化细胞发生凋亡，而对正常组织和细胞没有显著毒性效应。这一特殊的选择性使TRAIL在肿瘤治疗中具有很大的应用前景，因此，有必要对其进行研究开发。 TRAIL分子的活性部分位于第114～281氨基酸，近来有研究报道，氨基酸95位前的序列具有抑制TRAIL诱导的细胞凋亡能力，较短的重组可溶性TRAIL分子具有较高的生物学活性。胞外区41～281氨基酸片断是全长的可溶性TRAIL分子，含有胞外区的所有遗传信息，目前尚未见有关这一片断的研究报道。本实验运用基因工程的原理和方法克隆编码人胞外区41～281片断的cDNA，并将其插入原核表达载体pQE-80L中诱导蛋白表达，经纯化复性后，获得有生物学活性的重组可溶性人TRAIL41～281分子(rhsTRAIL41～281)。这既能为下一步探讨41～114氨基酸残基间是否存在辅助的功能位点奠定基础，也有利于研究胞外区可溶性分子的长短与其功能的关系，同时也可为临床上多种恶性肿瘤的治疗提供新型候选剂。 本文的主要研究方法、内容及结论如下：①利用RT-PCR技术从HL-60细胞总RNA中扩增编码人TRAIL胞外区41～281氨基酸片断的cDNA，经DNA测序后证实，扩增片断的序列与GenBank报道的完全一致。 ②将测序正确的人TRAIL胞外区41～281氨基酸片断的cDNA插入高效原核表达载体pQE-80L，限制性酶切鉴定结果表明，成功构建了重组pQE-80L/hTRAIL41～281质粒。 ③用重组表达载体转化大肠杆菌DH5α，IPIG诱导融合蛋白表达，SDS-PAGE进行鉴定。结果获得相对分子量为30.5KDa左右的特异表达蛋白，且表达量占细菌总蛋白的45％左右。 ④经鉴定表达蛋白以包涵体的形式存在。对包涵体进行分离溶解后，用Ni-NTA树脂进行纯化，得到纯度在90％以上的目的蛋白。 ⑤采用分步透析法复性蛋白，Westernblot证实该蛋白为rhsTRAIL41～281。通过凝胶过滤层析分离出复性蛋白的三种不同大小分子，分别与rhsTRAIL41～281的三聚体、二聚体和单体相对应，进一步证实这是目的蛋白。同时三聚体的存在为rhsTRAIL41～281发挥其生物学功能奠定了基础。 ⑥选用Jurkat细胞，采用多种方法检测rhsTRAIL41～281的体外抗肿瘤能力。rhsTRAIL41～281处理的Jurkat细胞的形态及生长状况通过显微镜观察、台盼蓝排斥试验和MTT试验进行检测。显微镜下观察到Jurkat细胞表现出凋亡的形态学特征，同时台盼蓝和MTT试验结果也显示rhsTRAIL41～281分子能有效抑制Jurkat细胞的生长，并且该作用有明显量效和时效关系。 应用流式细胞仪和DNA断裂实验检测细胞凋亡。流式细胞仪结果表明，rhsTRAIL41～281能有效诱导Jurkat细胞发生凋亡，并且这一效应呈良好量效与时效关系。DNA断裂实验的结果显示，经诱导的细胞出现了典型的DNA梯形条带，这一凋亡的特征性变化进一步证实rhsTRAIL41～281蛋白具有较好的抗肿瘤活性，并且提示该蛋白能通过诱导细胞凋亡的方式抑制细胞生长和杀伤肿瘤细胞，从而发挥其抗癌作用。 ⑦41～281片断作为全长的可溶性TRAIL分子，具有较好的抗肿瘤活性。在本研究中，功能性rhsTRAIL41～281分子的制备，为进行下一步的实验研究和开发利用奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

1绪论

1.1引言

1.2 TRAIL分子的国内外研究概况

1.2.1 TRAIL分子的结构与功能

1.2.2 TRAIL分子的受体

1.2.3 TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的机制

1.2.4 TRAIL与肿瘤治疗

1.3研究目的与研究方法

1.3.1研究目的

1.3.2研究方法

1.4研究内容与实验设计

2 TRAIL胞外区cDNA的克隆

2.1材料

2.1.1细胞系与质粒

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.2方法

2.2.1 HL-60细胞的培养

2.2.2 HL-60细胞总RNA的提取

2.2.3 RT-PCR反应

2.2.4重组质粒pUC1 8/hTRAIL41～281的构建

2.2.5 pUC18/hTRAIL41～281质粒转化大肠杆菌

2.2.6 pUC18/hTRAIL41～281重组子的筛选

2.2.7 hTRAIL41～281 cDNA序列分析

2.3结果

2.3.1 RT-PCR结果

2.3.2重组pUC18/hTRAIL41～281质粒的构建及鉴定

2.3.3重组pUC18/hTRAIL41～281质粒的DNA序列测定

2.3.4重组pUC19-hTRAIL41～281质粒的构建及鉴定

2.3.5重组pUC19/hTRAIL41～281质粒的cDNA序列测定

2.4讨论

2.4.1 PCR反应引物设计

2.4.2 RT-PCR反应

2.4.3 pUC18、pUC19质粒的选择

2.4.4质粒在大肠杆菌中的转化

3rhsTRAIL41～281的表达及纯化

3.1材料

3.1.1菌株及质粒

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器

3.2方法

3.2.1重组质粒pQE-80L/hTRAIL41～281的构建

3.2.2重组质粒pQE-80L/hTRAIL41～281的转化及鉴定

3.2.2融合蛋白的诱导表达

3.2.3表达蛋白的SDS-PAGE分析

3.2.4融合蛋白表达方式的鉴定

3.2.5表达蛋白的分离纯化

3.2.6目的蛋白的复性

3.2.7目的蛋白的鉴定

3.3结果

3.3.1重组质粒pQE-80L/hTRAIL41～281的构建及鉴定

3.3.2融合蛋白的诱导表达

3.3.3融合蛋白表达方式的鉴定

3.3.4目的蛋白的纯化及复性

3.3.5目的蛋白的鉴定

3.4讨论

3.4.1表达系统与表达质粒的选择

3.4.2融合蛋白的诱导表达

3.4.3表达蛋白的纯化

3.4.4目的蛋白的复性

3.4.5目的蛋白的鉴定

4 rhsTRAIL41～281分子的生物学活性检测

4.1材料

4.1.1细胞株

4.1.2主要试剂

4.1.3主要仪器

4.2方法

4.2.1细胞培养

4.2.2细胞凋亡的形态学特征观察

4.2.3台盼蓝排斥试验检测细胞活力

4.2.4细胞毒性试验

4.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡

4.2.6 DNA断裂实验

4.2.7统计学分析

4.3结果

4.3.1细胞凋亡的形态学特征观察结果

4.3.2台盼蓝排斥试验结果

4.3.3 MTT比色试验结果

4.3.4流式细胞仪检测结果

4.3.5 DNA断裂实验结果

4.4讨论

4.4.1 Jurkat细胞凋亡的形态学变化

4.4.2 rhsTRAIL41～281作用后细胞活力的检测

4.4.3 rhsTRAIL41～281诱导Jurkat细胞凋亡的定量检测

4.4.4 rhsTRAIL41～281诱导Jurkat细胞凋亡的定性分析

4.4.5 rhsTRAIL41～281的生物学活性分析

5全文总结及后续工作建议

5.1结论

5.2后续工作建议

致 谢

参考文献

附 录：作者在攻读博士学位期间发表的论文目录和参加的科研项目