有机物与生物分子相互作用的毛细管电泳法研究及应用

摘要

目前，环境中污染物的毒性评价大多是通过生物实验方法实现的，这些方法存在耗时、费用高、针对性差（因生物个体差异非常大且不同生长期也存在很大的差异）等不足，更不是一种基于作用机理的直接测试研究。为此，希望建立一种直接对污染物毒性进行评价的仪器分析方法，以便快速、准确地获得各种污染物的毒性数据。 本课题主要通过毛细管电泳相互作用分析方法研究污染物与受体的相互作用力的大小，实现对污染物生物活性及环境中污染物对生物体和人体的毒性作用的评价。因为污染物毒性的大小主要取决于它们与靶器官，也即受体作用的大小。对于某些受体，作用力大，相应的毒性也越大。结合常数是表征分子间相互作用强弱的主要参数，所以测定污染物与受体相互作用的结合常数的大小能间接地反映污染物的毒性的大小。 本课题首先研究结构上具有微小差别的邻、间、对硝基苯胺共存时对一种受体牛血清白蛋白的相互作用。采用磷酸盐为运行缓冲溶液，它的酸度与生物大分子和配体相互作用所需要的生理环境的酸度大体相似。实验结果显示，三种同分异构体与牛血清白蛋白相互作用的大小顺序是：邻硝基苯胺＞对硝基苯胺＞间硝基苯胺。相互作用后三种物质在检测波长下的紫外吸收强度发生了很大的变化，根据作用前后紫外吸收强度的变化，同时推算出的相互作用的大小顺序与毛细管电泳相互作用分析的结果是一致的。并初步比较了测得的结合常数值与这三种物质的另外一些理化参数以及毒性数据的相关性，发现它们之间有一定的相关性。 论文研究进一步将八种苯胺类化合物混合在一起，测定它们共存时与牛血清白蛋白的相互作用，模拟环境中的多组分共存复杂体系，使其更接近生物体真实的结合行为。求出它们结合常数的大小顺序是：苯胺＜邻甲苯胺＜对甲苯胺＜间硝基苯胺＜对硝基苯胺＜邻硝基苯胺＜N, N-二甲基苯胺＜甲萘胺。对这些结合常数与八种物质的生物实验毒性数据及其分子结构参数等进行相关性分析，发现它们之间存在较好的相关性。表明了用毛细管电泳相互作用分析方法评价环境中共存多种污染物的生物毒性具有一定可行性。 最后，针对常规前沿分析法存在的不足之处，初步建立了毛细管电泳/改进型前沿分析法，该方法保证了绘制工作曲线的配体的峰高与平衡体系中游离配体峰高的一致性，减小了实验误差，提高了测定结果的准确度。在比较研究毛细管电泳峰漂移法和毛细管电泳改进型前沿分析法的基础上，考察了两种方法在计算间硝基苯胺与牛血清白蛋白相互作用结合常数方面的差异，并获得两者的结合常数，两种方法求得的结合常数较为一致，从而验证了改进后的毛细管电泳前沿分析法的可靠性。并应用改进型前沿分析法测定了联苯胺与牛血红蛋白的相互作用结合常数，分别利用Scatchard方程和Klotz方程进行线性回归，得到的结合常数和结合位点数具有很好的一致性，证明了该方法的正确性和适用性。