去内皮异种血管内皮化的实验研究——流动切应力对血管内皮化的影响

摘要

心血管系统疾病因发病率高，越来越受到人们的关注。在临床上，治疗这一类疾病常常需要大量的小口径（内径<6mm）血管移植物。目前小口径血管移植物在体内容易发生血栓而导致血管堵塞，故在临床应用中受到了很大的限制。有关小口径血管移植物当前的研究热点是，体外构建好的血管移植物在植入体内后，如何避免发生免疫排斥反应，能保持完整的内皮细胞单层且不会被血流冲掉。本研究采用人脐静脉内皮细胞株（ECV-304）作为种子细胞，以超低温慢冻速融法去除血管内皮细胞的鼠颈总动脉为血管基质材料，用我们设计的血管体外应力培养系统进行内皮细胞的流动培养，然后用两种形式的流动切应力对内皮细胞进行应力“驯化”培养，通过比较两种形式的切应力对内皮细胞形态结构和粘附力的影响，得出种植在血管壁上的内皮细胞在生理水平范围内，所能耐受的理想的切应力的作用方式，以及相应的切应力大小和作用时间，从而提高血管移植物植入体内后内皮细胞的抗冲击能力，更好地保持内皮细胞单层的完整性，以期为小口径血管移植物的成功内皮化提供可靠的研究方法和参考依据。 本研究的主要内容和结论是： （1）采用超低温慢冻速融法去除大鼠颈总动脉（内径约1mm）的内皮细胞，血管铺片硝酸银染色法、内皮细胞 F-actin荧光标记法和扫描电镜检测结果显示，这种方法可完全去除血管内皮细胞，而且血管内弹性膜保持完好，血管组织结构保留完整。 （2）根据实验需要设计出一种血管体外应力培养系统。该系统具有组装简单，操作方便，占用空间小的优点，能较好地控制系统中的流动切应力大小，可提供在生理范围内（0－40dyne/cm2）的血流动力学环境。 （3）将培养状态良好的ECV-304高密度种植于去内皮细胞的鼠颈总动脉内壁上，动态旋转种植与静态培养相结合种植培养三天后，血管铺片硝酸银染色法和内皮细胞 F-actin荧光标记法检测结果显示，种植后的内皮细胞完全覆盖在血管壁上，形成完整的细胞单层，生长状态较好。 （4）设计了两种形式的流动切应力对种植后的内皮细胞进行力学加载实验。加载实验结果表明： ① 单一形式的切应力（5、10、15、20、25、30dyne/cm2）对内皮细胞的作用：低切应力（5和10dyne/cm2）长时间（24h）的作用效果较高切应力（15和20dyne/cm2）短时间（2h）的作用效果既有相似之处，又有细微不同，血管壁上的内皮细胞会发生一定的形态变化，有部分细胞脱落；随着加载流动切应力的不断增加，作用后的内皮细胞形态变化逐渐明显，沿液流方向一致排列，细胞脱落逐渐增多，但细胞粘附力在逐渐增强；高切应力（30dyne/cm2）作用2h后，血管壁上的内皮细胞几乎全部脱落； ②设计了四组成梯度增加的切应力（5－15dyne/cm2、5－20dyne/cm2、5－25dyne/cm2、5－30dyne/cm2）（均是按每2h增加2dyne/cm2的方式）对内皮细胞进行力学作用。它们对内皮细胞的作用效果为，与单一形式切应力的作用效果相比，此种切应力对内皮细胞的作用效果更明显，主要表现为内皮细胞的形态结构变化更明显，细胞脱落相对减少，细胞粘附力明显增强；比较这四组不同大小的切应力作用效果得出，从5dyne/cm2成梯度增加到30dyne/cm2的切应力作用方式，能基本保持内皮细胞层的完整性，并且能诱导内皮细胞中应力纤维的出现，增强了内皮细胞的粘附力，提高了内皮细胞抵抗血流冲击的能力，是一种效果较好的切应力加载方式。 （5）在比较短的时间内完成了异种血管内皮化。先是以高密度种植ECV-304，采用动态旋转加静态培养的方法进行细胞种植培养，三天后血管已完全内皮化；然后从5dyne/cm2成梯度增加到30dyne/cm2的切应力作用内皮细胞（每2h增加2 dyne/cm2）需要26h的时间，因此较好地完成异种血管内皮化过程需要98h。