柑桔溃疡病生防菌株枯草芽孢杆菌CQBS03的研究

摘要

柑桔溃疡病(Citrus Bacterial Canker Disease,CBCD)是严重危害世界柑桔种植业的一种细菌性病害，其病原物为地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.citri=Xanthomonas campestris pv.cirri，Xac)，是国内外重大检疫性有害生物。该病菌能侵染绝大多数商品化栽培柑桔品种，导致落叶、落果、树势衰弱和果实生锈斑且品质变劣，严重降低了果品的商品价值及产量。由于该病对柑桔产业的影响，在美国、巴西、澳大利亚、中国等大多数国家和地区的非疫区，对外来入侵的柑桔溃疡病采用挖树烧毁根除法，给这些国家和地区的经济带来了重大损失。而在病区，人们采取化学防治为主、农业防治为辅的综合防治策略，以控制病菌危害。但化学保护法也只能在一定程度上降低发病率，而且病原菌会对一些药物产生耐药性，并且使用化学农药对环境生态有污染，同时也不能满足人们对安全的要求。而用生物防治方法由于采用自然界本身存在的生物或其产物，很少会对环境产生影响，而且它们的毒性普遍也较低，不易在果实上残留，因而受到人们的广泛关注。 本研究以从柑桔叶片上筛选出的对柑桔溃疡病菌有良好抑制作用并产生拮抗物质的拮抗细菌CQBS03为实验材料，对该菌的分类地位、抑菌活性与抑菌谱、最佳培养发酵条件、抑菌活性成分的特性进行了系统研究，并对抑菌活性物质进行了初步分离纯化，取得了以下研究结果： 1)采用纸碟法进行的CQBS03菌株及其活性成分粗提物抑菌试验结果表明，拮抗细菌CQBS03的抑菌谱很广，对柑桔溃疡病菌、柑桔绿霉、芒果炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌以及腐生黄单胞杆菌等十几种植物病原菌都有较好的抑制效果，特别对于柑桔溃疡病菌有较强的抑菌效果，有着良好的应用前景。 2)结合形态学、生理生化特性分析和16S rDNA序列分析结果对CQBS03菌株进行了种属鉴定，鉴定结果发现，该菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)有99％的同源性，生理生化特性等也与典型的枯草芽孢杆菌相一致，且二者在系统发育树中处于同一个分支，最终确定CQBS03应该属于枯草芽孢杆菌B.subtilis的一个菌株。 3)通过单因素实验和正交设计实验筛选优化了CQBS03菌株的最佳培养发酵条件。最适培养基为YPG液体培养基，产抑菌物质的最适培养条件为：发酵培养温度28℃，初始pH8.0，摇瓶装液量1/5体积，接种量5％，摇床转速250 r/min，发酵周期72h。 4)利用饱和硫酸铵盐析，获得抑菌活性成分粗提物。该粗提物70℃处理30 min后，活性显著下降，100℃处理30 min后则完全失活，表明其不耐高温；抑菌活性成分对胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感，对氯仿敏感，分子量大于10kDa，等电点(pI)为5左右。初步认定此抑菌活性成分为蛋白质类物质，5)采用抑菌活性检测和SDS-PAGE跟踪检测，通过盐析结合疏水层析方法从COBS03的发酵液中初步分离纯化到一抗菌蛋白，通过SDS-PAGE电泳分析，该抗菌蛋白的分子量在55 kDa左右。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1研究背景

1.1.1引言

1.1.2柑桔溃疡病防治的国内外研究现状

1.2研究的目的

1.3研究意义

1.4研究的主要内容和技术路线

1.4.1主要研究内容

1.4.2技术路线

1.5本研究的创新点

2文献综述

2.1柑桔溃疡病

2.1.1柑桔溃疡病病原菌

2.1.2柑桔溃疡病的起源和分布

2.1.3柑桔溃疡病菌系分化

2.1.4柑桔溃疡病的症状、危害和传播方式

2.2植物生防枯草芽孢杆菌

2.2.1枯草芽孢杆菌用于植病防治的研究概况

2.2.2枯草芽孢杆菌拮抗作用机理研究进展

2.2.3枯草芽孢杆菌研究中存在的问题和展望

3 CQBS03菌株特性、抗菌谱测定与菌种鉴定

3.1材料

3.1.1主要仪器

3.1.2主要试剂和缓冲液

3.1.3实验菌种

3.1.4主要培养基

3.1.5引物合成

3.2方法

3.2.1菌株特性测定

3.2.2抑菌活性的测定方法

3.2.3菌株CQBS03的抑菌作用及抑菌谱测定

3.2.4芽孢杆菌CQBS03的16S rDNA序列鉴定

3.3结果与分析

3.3.1菌株特性测定

3.3.2菌株CQBS03的抑菌作用及抑菌谱测定

3.3.3芽孢杆菌CQBS03的16S rDNA序列鉴定

3.4 小结

4 CQBS03菌株发酵条件的优化

4.1材料

4.1.1主要仪器

4.1.2实验菌种

4.1.3主要培养基

4.1.4试验设计和数据分析

4.2方法

4.2.1种子液制备方法

4.2.2摇瓶发酵培养液配方筛选

4.2.3培养条件的单因素实验设计

4.2.4培养条件的正交实验设计方法

4.2.5菌株CQBS03生长曲线、抑菌活性物质产生曲线的绘制

4.3结果与分析

4.3.1不同培养基对抑菌活性物质产生的影响

4.3.2单因素选择结果

4.3.3菌株CQBS03生长与抑菌活性物质产生的关系

4.3.4菌株CQBS03发酵上清抑菌活性曲线与OD280吸收曲线的关系

4.3.5正交实验结果及回归分析

4.4 小结

5 CQBS03抗菌物质性质的研究和抗菌蛋白的分离纯化

5.1材料

5.1.1主要仪器

5.1.2主要试剂

5.1.3实验菌种和所用培养基

5.1.4 SDS-PAGE和IEF-PAGE所用缓冲液和储备液

5.1.5其它材料

5.2方法

5.2.1拮抗细菌粗蛋白的提取

5.2.2抗菌蛋白浓度的测定方法

5.2.3 CQBS03抑菌活性成分性质测定

5.2.4抗菌蛋白的分离纯化

5.3结果与分析

5.3.1抑菌活性成分的来源

5.3.2标准蛋白浓度的测定结果

5.3.3硫酸铵分级盐析条件的确定

5.3.4抗菌蛋白抑菌谱的测定

5.3.5抗菌蛋白性质研究结果

5.3.6抗菌蛋白疏水柱层析

5.4 小结

6结论与讨论

6.1结论

6.2讨论

6.2.1关于细菌菌株的鉴定

6.2.2抑菌活性测定方法的比较与选择

6.2.3枯草芽孢杆菌的抗菌谱

6.2.4枯草芽孢杆菌的抗菌活性物质

6.2.5有关抗菌蛋白的分离纯化

6.3后续研究思路

7展望

致 谢

参考文献

附 录