棉花腺体形成时期相关基因的克隆与分析

摘要

植物次生代谢物质的有无及含量与其贮藏器官－腺体（或腺毛）的有无及多少密切相关。了解次生代谢物质贮藏器官发生与形成的基因网络及及其调控机制，能为实践中有效的调控植物次生代谢提供理论依据。其中，棉属植物的棉酚与其贮藏器官腺体（gland）是研究次生代谢工程较理想的一个研究模式。
　　棉酚（Gossypol）为锦葵科棉族(Gossypieae)植物特有，存在于色素腺体（pigment gland）中，是棉花自身重要的抗性物质，但由于棉酚对人类和单胃动物有毒，限制了丰富的棉籽蛋白及油脂资源的利用。为有效调控棉酚合成，极有必要对色素腺体形成的分子机制进行研究。
　　本论文的研究首先以“湘棉18”特殊腺体为材料（种子无腺体，植株有腺体，种子萌发过程中腺体逐渐增多。），构建了其腺体形成时期的均一化全长 cDNA文库。其次，选用湘棉18，川2082（种子、植株都有腺体），无腺体棉－显无N5（种子、植株都无腺体）为材料，利用不同的材料腺体差别，通过棉花基因芯片，对腺体形成时期的基因进行高通量筛选，筛选到的明显表达变化的基因后，在所建 cDNA文库中进行克隆，筛选到相关基因后，结合生物信息学方法对所克隆的基因进行功能预测，并对其展开了不同部位的时空表达研究，从而为揭示棉花腺体形成提供了重要的分子机制理论依据。
　　实验研究结果如下：
　　1.湘棉18腺体形成时期均一化全长cDNA文库构建：
　　构建了湘棉18腺体形成时期的均一化全长 cDNA文库，主要采用SMART（Switching mechanism at5 end of RNA transcript）技术与DSN技术(Duplex-specific nuclease)相结合的方法，即 mRNA逆转录后合成cDNA，经均一化处理后，Sfi I酶切，连接在质粒载体，电转化，最后获得5.86×105个独立克隆，重组率高达94％，插入片段的平均长度约为1.4 kb，从而成功建立棉花腺体形成相关基因的cDNA文库。通过均一化文库的建立，使文库中高丰度基因拷贝数有了很大程度的降低，而低丰度基因的丰度得到相对提升，从而大大增加了从文库中克隆发现新基因的概率。
　　2．棉花腺体发育过程中的基因表达变化的高通量分析
　　为了对棉花腺体形成提供更多信息，本研究利用高通量的方法分析了棉花腺体形成过程中的基因表达变化。采用包含大约23,977个基因探针的Affymetrix棉花基因芯片，以湘棉18突变体、野生棉（川2802）、无腺体棉（显无N5）为研究材料，对腺体形成过程中差异表达的基因进行了鉴定。结果显示，在腺体形成过程中，湘棉18腺体形成时、湘棉18腺体形成前、无腺体棉N5三种材料中的共同有差异表达的基因311条，其中112条上调，191条下调；川（2802）、湘棉18腺体形成前、无腺体棉N5的共同差异表达的基因有549条，其中218条上调，331条下调。上述基因主要涉及蛋白质聚合、微管运动、脂类合成、氨基酸磷酸化、代谢途径调控的酶基因、受外界胁迫表达的抗逆相关基因、光合作用相关基因、转录调控因子等以及其它一些未知功能的基因。接着采用RT-PCR验证了其中6个基因，均与芯片结果一致。从中可以推测，腺体的形成是多因素多基因共同作用的结果，它们通过相互调节并形成调控网络，从而直接或间接地导致腺体的形成。
　　3．棉花腺体形成相关的基因GRP1的克隆和分析
　　从基因芯片筛选的与腺体形成相关的基因中，选取 DW513956设计引物，对均一化全长文库进行PCR筛选，获得全长序列，命名为GRP1（GeneBank收录号：EU3703012）。GRP1基因全长为1203 bp的cDNA序列，开放阅读框起始位点为25bp处，终止位点为771bp处，编码248个氨基酸。蛋白分子量为33.09 KD，理论等电点pI为8.99，亚细胞定位在胞质内，GRP1属于疏水分泌性蛋白质，有一个信号肽，具分泌型过氧化物酶的保守区域。与烟草的过氧化物酶，红豆的过氧化物酶，大戟等的相似度较高，分别为75%，75%，73%。
　　对GRP1基因，进一步应用原位杂交的方法分析其表达的具体部位，从分子水平研究腺体形成的机理，发现其mRNA的表达主要集中在植株的纤维化程度高的部位，如导管、厚壁细胞等位置，在薄壁细胞处表达量少。
　　4.腺体形成相关的基因GRP2的克隆和分析和的进一步分析
　　从基因芯片筛选的与腺体形成相关的基因中，选取 DT463838进行了深入分析。首先对均一化全长文库进行PCR筛选，获得全长序列，命名GRP2（GeneBank收录号：EU3703033）。GRP2基因全长为1989 bp的cDNA序列，起始位点为135bp处，终止位点为1598bp处，编码487个氨基酸。蛋白分子量为53.75KD，理论等电点pI为5.79，亚细胞定位在质膜上，为疏水性，跨膜锚定蛋白，具转运蛋白保守区域。
　　对GRP2基因，其mRNA的时空表达研究发现，在腺体形成前有表达，在腺体形成后表达信号弱，在成熟植株细胞中，其mRNA的表达广泛，有散在分布。没有区域特异性。
　　通过本研究，为了解腺体形成的分子机制奠定了坚实的基础。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩写一览表

1 绪 论

1.1 研究背景

1.2 研究现状及应用价值

1.3 本研究的目的和研究内容

2 棉花突变体（湘棉-18）均一化全长cDNA文库的构建

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

3 基因芯片筛选棉花腺体形成相关基因

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

4 腺体发育相关基因GRP1的克隆

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

5 腺体发育相关基因GRP2的克隆

5.1 材料与方法

5.2 结果

5.3 讨论

6 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

致谢

参考文献

附录